3 外文名
Purified Protein derivative Tuberculin ,PPD
6 結核菌素純蛋白衍化物（TB-PPD）製造及檢定規程
本品系用結核桿菌經液體表面培養、蒸汽殺菌過濾除去菌體，用沉澱分離、洗滌及再溶解的提純方法製成的液體或凍乾製品，含有從結核桿菌培養濾液中獲得的活性物質，其主要成分是蛋白質，對已受結核菌感染或曾接受卡介苗免疫的機體，能引起特異的皮膚變態反應。用於檢查結核桿菌的感染及觀察免疫反應。
6.1 菌種
1.1 菌種由中國藥品生物肉製品檢定所分發或經同意。
1.2 製造TB-PPD用人型結核桿菌，菌號93009（H37Rv）。菌種應有完整的歷史資料，經過全面檢定，凍幹保存。
6.2 製造
全部生產過程，包括殺死分枝桿菌，應在完全隔離的區域內用專用設備進行。
使用蘇通馬鈴薯培養基，改良蘇通綜合培養基，或其他適宜培養基。培養基中應不含已知能對人或動物造成毒性和變態性反應的成分。
2.2 啓開菌種（菌種批）反接種於蘇通馬鈴薯培養基上。置37℃培養2～3周，可在蘇通馬鈴薯培養基上再傳一代或直接挑取蘇通馬鈴薯管內生長良好的菌膜，移種於改良蘇通綜合培養基或其他適宜培養基的表面，置37℃靜止培養1～2周，供大量接種用。
2.3 大量接種
挑取發育良好的菌膜移種於改良蘇通綜合培養基或其他適宜培養基的表面，置37℃靜止培育8～10周。凡在培養期間或培養終止時，有菌膜下沉、發育異常或污染雜菌者，必須廢棄。
2.4 殺菌
培養終止，將培養物加熱，121℃30分鐘進行殺菌處理。
2.5 除菌
殺菌後用濾器除去菌膜及菌體，收集濾液並取樣做無菌試驗，然後，加入0.3%苯酚或其他適宜的防腐劑。濾液保存在4～8℃，但要防止凍結。
2.6 提純
用三氯乙酸和飽和硫酸銨法分別沉澱蛋白，加壓過濾除去清液，並收集沉澱物於3μm孔徑的濾膜上，然後用10%氯化鈉液洗酸脫鹽至中性爲止，最後以磷酸鹽緩衝液將沉澱物溶解，除菌過濾後即爲原液。亦可採用其他適宜方法提純。
2.7 分批
2.8 半成品檢定
2.8.1 物理檢查
原液應爲深棕色的澄明液體，不應有沉澱物或其他雜質。
2.8.2 無菌試驗
按《生物製品無菌試驗規程》進行。
2.8.3 安全試驗
用體重300～400g健康豚鼠2只，每隻腹腔注射原液1.0ml，觀察6周，檢查其症徵或死亡。所有在試驗後24小時內死亡的或表現出症徵的動物應作鏡檢，然後將有關的組織鏡檢和培養，檢查其有無分枝桿菌存在的證據。觀察期中活存的動物也要以同樣方法檢查。
如果分析桿菌活菌培養試驗陰性，在觀察期中全部豚鼠健康存活，無一動物出現分枝桿菌的症徵，則可判定濃縮原液通過試驗。
2.8.4 致敏效應試驗
實驗組與對照組分別用體重300～400g未做過任何試驗的健康豚鼠各3只，實驗組每隻豚鼠皮內注射0.1ml含500IUTB—PPD樣品，共3次，每次間隔5天，在第3次注射後15天，實驗組與對照組每隻豚鼠各皮內注射0.1ml含500IUTB—PPD樣品，連續觀察3天，兩組動物反應不應有明顯區別。
2.8.5 純度測定
應測定蛋白（凱氏定氮法）、多糖（蒽酮法）與核酸（紫外分光光度法）含量。蛋白含量應≥90%，多糖含量≤3%。
2.8.6 效價測定
TB—PPD標準品由中國藥品生物製品檢定所提供。
2.8.6.1 動物試驗
將標準品及待檢原液分別稀釋馬0.1ml含100IU、20IU及4IU或其他適宜的稀釋度，用體重400～600g已致敏的白色雌性豚鼠最少4只，去毛後於背部脊柱兩側相對部位，分別皮內注射上述稀釋度各0.1ml（從尾側起先注射稀釋度最高者）。於注射後24、48小時各觀察結果1次（可根據48小時的反應結果判定），算出待檢和標準TB-PPD的平均硬結反應（縱橫直徑相加除2）計算累計值，並求其比值，比值1±0.2者爲合格。
也可按WHO規程要求，標準品及待檢樣品分別稀釋3個不同的適宜稀釋度，用6只致敏豚鼠，以輪圈法注射於豚鼠背部兩則，每側3點，每點皮內注射0.1或0.2ml樣品，用雙盲法分別記錄24及48小時局部硬結的縱徑與橫徑。計算每個稀釋度2天的總和（也可計算2天的平均面積），並求其比值，比值1±0.2者爲合格。
稀釋度的選擇應能使注射後24小時所產生的局部硬結反應直徑不小於8mm，不大於25mm，兩個樣品的反應直徑大致相同及兩個樣品的3個稀釋度的劑量對數反應線應基本平行。
如待檢樣品效價與標準品效價不一致，可用同樣方法重試一次，並算出相當於標準品的效價進行調整，調整後再重新抽樣測定效價，直至合格。
動物試驗合格後，應進行小量人體測定，選擇對TB—PPD1IU（好0.02μg結核蛋白）反應陽性的敏感成人最少5人或者皮內接種卡介苗12周後免疫效果觀察的嬰幼兒至少20人，每人於兩前臂內側相對部位分別注射5IU的標準品與待檢樣品各0.1ml，注射後72小時觀察結果，並求其比值（計算方法與2.8.6.1項相同）。比值1±0.2，並無1例異常反應者爲合格。
2.9 分裝凍幹
經物理檢查、無菌試驗、安全試驗、致敏效應試驗、蛋白質含量及效價測定合格後，即可根據蛋白質含量將原液進行定量稀釋至規定濃度，然後定量分裝安瓿，每安瓿裝量爲0.5ml，分裝後立即進行凍幹。每安瓿的分裝誤差應符合標準品的要求（差異係數不超過1%）。
6.3 濃縮物檢定
3.1 物理檢查
凍幹TB—PPD應爲白色疏鬆體，無融化跡象。加入稀釋液後，應於3分鐘內全部溶解，呈棕黃色澄明液體，不得有不容物或雜質。
如系液體原液，亦應爲棕黃色澄明液體，不應有不溶物或雜質。
3.2 水分測定
凍乾製品水分含量應≤3%。
3.3 無菌試驗
按《生物製品無菌試驗規程》進行。
3.4 安全試驗
按2.8.3項進行。
3.5 純度測定
按2.8.5項進行。
3.6 致敏效應試驗
按2.8.4項進行。
3.7 效價測定
動物試驗按2.8.6.1項進行。人體反應測定按2.8.6.2項進行。但觀察人數需增加1～2倍。
3.8 保存與效期
保存於2～8℃冷暗處。凍乾製品自效價測定合格之日起效期爲10年。液體原液自效價測定合格之日起效期爲5年。
6.4 TB—PPD和稀釋
4.1 稀釋
經檢定合格的濃縮物用內含0.0005%吐溫80及0.3%苯酚的pH7.2～7.4的0.01mol的磷酸鹽緩衝生理鹽水稀釋至20IU或50IU。
各處稀釋用具應專用。加入TB—PPD後應充分搖勻，並逐瓶抽樣作無菌試驗，合格後分裝。
4.2 分批
每次稀釋的同一濃度的稀釋TB—PPD爲一批，同時有數瓶者，按瓶分爲亞批。
4.3 分裝
由專人用專用工具進行。
6.5 成品檢定
5.1 物理檢查
分裝後應進行破漏、裝量、外觀檢查。應爲無色澄明液體，不得有不容物或雜質。
5.2 化學檢查
pH值應爲6.8～7.4。苯酚含量應爲0.25%～0.5%。
5.3 無菌試驗
按《生物製品無菌試驗規程》進行。
5.4 防腐劑試驗
用體重18～20g小白鼠2只，各皮下注射樣品0.5ml，小白鼠震顫時間不得超過半小時，觀察7天，不得有局部膿腫或死亡。
5.5 安全試驗
每批用體重18～20g小白鼠5只，各腹腔注射樣品0.5ml，觀察1周，小白鼠應健康活存。
5.6 效價測定
按2.8.6.1項進行。比值1±0.2者爲合格。
6.6 保存與效期
保存於2～8℃暗處。自稀釋檢定合格之日起效期爲1年。
7 50IU/ml結核菌素純蛋白衍化物（TB-PPD）使用說明書
本品爲每ml含50IU結核菌素純蛋白衍化物（TB—PPD）的稀釋製劑，經與國家標準品標準，達到完全一致。專供結核病的臨牀診斷，卡介苗接種對象的選擇及卡介苗接種後質量監測用。
7.1 對象
7.2 用法
吸取上述稀釋液0.1ml（5IU），採取孟都氏法注射於前臂掌側皮內，於注射後48～72小時檢查注射部位反應。測量應以硬結的橫徑及其垂直徑的mm數記錄之。反應平均直徑≥5mm爲陽性反應。凡有水泡、壞死、淋巴管炎者均屬強陽性反應，應詳細註明。
7.3 禁忌
患急性傳染病（如麻疹、百日咳、流行性感冒、肺炎等），急性眼結合摸炎，急性中耳炎，廣泛性皮膚病者暫不宜使用。
7.4 注射事項
1.注射器及針頭應當專用，不可作任何其他注射之用。
2.安瓿有裂紋、製品內有異物者不可使用。
7.5 保存
本品爲已稀釋製品，於2～8℃保存，效期爲1年。
20IU/ml結核菌素純蛋白衍化物（TB—PPD）使用說明書（專供流行病學調查用）
本品爲每ml含20IU結核菌素純蛋白衍化物（TB—PPD）的稀釋製劑，經與國家標準品及PPD—PT23標化，達到完全一致。專供結核病流行病學調查及臨牀疑似結核病人診斷用。
7.6 用法
吸取上述稀釋液0.1ml（2IU），採取孟都氏法注射於前臂掌側皮內，於注射後48～72小時檢查注射部位反應。測量應以硬結的橫徑及其垂直徑的mm數記錄之，反應平均直徑≥6mm爲陽性反應。凡有水泡（包括微小水泡）、壞死、淋巴管炎者均屬強陽性反應，應詳細註明。
7.7 反應判定及處理
凡強陽性及硬結直徑≥20mm，或3歲以內未接種過卡介苗的兒童（根據接種史和檢查局部卡痕確定），結素反應陽性者，即使胞部透視正常，仍需按活動性結核處理，並建議予以內服異煙肼半年至1年。
7.8 禁忌
患急性傳染病（如麻疹、百日咳、流行性感冒、肺炎等）、急性眼結合膜炎、急性中耳炎、廣泛性皮膚病者暫不宜使用。
7.9 注意事項
1.注射器及針頭應當專用，不可作任何其他注射之用。
2.安瓿有裂紋、製品內有異物者不可使用。
7.10 保存
本品爲已稀釋製品，於2～8℃保存，效期爲1年。
8 20IU/ml結核菌素純蛋白衍化物（TB—PPD）使用說明書（專供流行病學調查用）
本品爲每ml含20IU結核菌素純蛋白衍化物（TB—PPD）的稀釋製劑，經與國家標準品及PPD—PT23標化，達到完全一致。專供結核病流行病學調查及臨牀疑似結核病人診斷用。
8.1 用法
吸取上述稀釋液0.1ml（2IU），採取孟都氏法注射於前臂掌側皮內，於注射後48～72小時檢查注射部位反應。測量應以硬結的橫徑及其垂直徑的mm數記錄之，反應平均直徑≥6mm爲陽性反應。凡有水泡（包括微小水泡）、壞死、淋巴管炎者均屬強陽性反應，應詳細註明。
8.2 反應判定及處理
凡強陽性及硬結直徑≥20mm，或3歲以內未接種過卡介苗的兒童（根據接種史和檢查局部卡痕確定），結素反應陽性者，即使胞部透視正常，仍需按活動性結核處理，並建議予以內服異煙肼半年至1年。
8.3 禁忌
患急性傳染病（如麻疹、百日咳、流行性感冒、肺炎等）、急性眼結合膜炎、急性中耳炎、廣泛性皮膚病者暫不宜使用。
8.4 注意事項
1.注射器及針頭應當專用，不可作任何其他注射之用。
2.安瓿有裂紋、製品內有異物者不可使用。
8.5 保存
本品爲已稀釋製品，於2～8℃保存，效期爲1年。