3 產品名稱
通用名稱：H7N9亞型禽流感病毒RNA檢測試劑盒（熒光PCR法）
英文名稱：Diagnostic Kit for H7N9 subtype avian flu virus RNA（Fluorescence PCR）
4 包裝規格
48人份/盒。
6 檢驗原理
根據熒光PCR技術原理，針對H7N9亞型禽流感病毒的HA基因和NA基因設計特異性引物和Taqman探針，通過熒光PCR檢測儀進行檢測，從而實現對H7N9亞型禽流感病毒RNA的定性檢測。試劑盒以正常人上皮細胞中廣泛存在的核糖核酸酶P（RNase P）的mRNA爲正常人體細胞對照，對提取和檢測過程進行監控。
7 主要組成成分
名稱 | 成分 | 數量（管） | |
H7反應液 | 含內標RNP 、H7亞型特異基因的引物探針混合液 | 1.0ml/管 | 1 |
N9反應液 | 含內標RNP 、N9亞型特異基因的引物探針混合液 | 1.0ml/管 | 1 |
DNA聚合酶 | DNA聚合酶，不可用其他同類DNA聚合酶替代 | 60μl /管 | 1 |
60μl /管 | 1 | ||
陽性對照 | 1.0ml/管 | 1 | |
陰性對照 | DEPC水 | 1.0ml/管 | 1 |
本品各組成成分均不得與其他產品或不同批號產品中的相應組成成分進行互換。
本品不包含，但對試驗必須的設備和試劑：
生物安全櫃、臺式離心機、旋渦震盪器、拭子、採樣管、無菌病毒採樣液、1.5 ml無核酸酶的離心管、全自動熒光PCR檢測儀專用PCR擴增管和核酸分離試劑盒（硅膠膜吸附法，北京金豪製藥股份有限公司，Cat：BJH101）。
9 適用儀器
RG3000、LightCycler、ABI Prism 7500、ABI Prism 7000型全自動熒光PCR檢測儀。
10 樣本要求
1. 樣本類型：咽拭子。推薦使用金豪公司生產的微生物採樣及運送管（12人份/盒）。
2.1拭子選擇：應使用頭部爲合成纖維（例如，聚酯纖維），杆部爲鋁或塑料的拭子。
2.2採樣管：外螺旋口、耐-70℃凍存，可容納3 ml病毒採樣液。
2.3無菌病毒採樣液：應含有蛋白質穩定劑，阻止細菌和真菌生產的抗生素，緩衝液，經無菌處理。
由於H7N9亞型禽流感病毒爲呼吸道傳播病毒，有關生物安全應按照“《人間傳染的病原微生物名錄》”中高致病性禽流感病毒進行管理。
3.1採集：採集病人發病3日內的咽拭子標本，用於病原檢測。用微生物採樣及運送管內的採樣棉籤，適度用力拭抹咽後壁和兩側扁桃體部位，應避免觸及舌部；迅速將棉籤放入裝有3ml保存液的15ml外螺旋蓋採樣管中，在靠近頂端處折斷棉籤杆，旋緊管蓋並密封，以防乾燥，外表貼上帶有唯一識別號碼的標籤。4℃暫存並在48小時內送達實驗室。
3.2保存和運輸：新鮮採集樣本應在4℃條件下48小時運送到檢測實驗室。保存樣本可在-20℃以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標本存於-70℃冰箱。冷凍樣本應在冷凍條件下送至實驗室。運輸時在包裝箱內填充吸水材料，運輸過程中保持標本採集管直立狀態，不能傾斜。
樣本送至實驗室後，立即進行處理和分裝，避免反覆凍融。臨牀樣本保存在4℃不能超過4天。
4.咽拭子標本的處理
咽拭子要在標本保存液中充分攪動（至少 40 下），以洗脫拭子上粘附的病毒及含有病毒的細胞等，用於病毒分離時，需要凍融一次（防止多次凍融），使細胞破裂，釋放病毒顆粒。然後在4℃條件下，10000rpm離心20分鐘，用上清接種細胞或直接提取RNA。如果發現有細菌污染，須用濾器過濾除菌。
11 檢驗方法
1. 核酸提取：
取200μl咽拭子樣本進行核酸提取。採用北京金豪製藥股份有限公司的核酸分離試劑盒 （硅膠膜吸附法），該試劑盒可用於對呼吸道懸浮液樣本中的病毒RNA提取，並按試劑盒介紹要求操作。
1.1. 準備及注意事項：
1.1.1 分別在洗液A瓶和洗液B瓶中加入16ml和60ml無水乙醇，顛倒充分混勻，並在瓶身上加以標識。
1.1.2 吸取所需的洗脫液，加至一無核酸酶的eppendorf管中，於70℃預熱。
1.1.3 冷凍樣本應室溫融化，輕微震盪混勻後使用。
1.1.4 區分操作中的離心設置（rpm和g），本產品操作過程均爲室溫離心。
1.1.5 助沉劑在低溫保存時可能呈膠狀，吹打混勻即可使用。
1.2.1 在1.5ml無核酸酶的離心管中加入10μl助沉劑和400μl裂解液，加入200μl待處理樣本，劇烈震盪2分鐘，室溫靜置10分鐘。
注：如樣本體積小於或大於200μl，需按比例改變助沉劑、裂解液以及無水乙醇體積。體積大於400μl樣本應分多次進行處理。
1.2.2 加入480μl無水乙醇，顛倒混勻，吸取600μl裂解混合物轉移到核酸吸附柱中。
1.2.3 3500g離心2分鐘，取下套管，倒掉套管中的液體。將剩餘裂解混合物轉移至核酸吸附柱，重新離心一次，棄套管中的液體。
1.2.4 將核酸吸附柱重新裝入套管，6000g離心1分鐘，倒掉套管中的液體。
1.3. 核酸純化
1.3.1 將核酸吸附柱重新裝入套管，在核酸吸附柱中加入500μl洗液A，6000g離心1分鐘，將核酸吸附柱裝入一個乾淨套管中。
1.3.2 在核酸吸附柱中加入500μl洗液B，靜置1分鐘，6000g離心1分鐘。
1.3.4 重複一次1.3.2步驟（本步驟不用靜置1分鐘）。
1.3.5 將核酸吸附柱換一新套管，13000rpm離心3分鐘。
1.4.1 將核酸吸附柱裝入一無核酸酶1.5ml離心管，小心在吸附膜中央加入50μl預熱洗脫液，室溫靜置4分鐘。
1.4.2 10000 rpm離心2分鐘，離心管中液體即待測樣本RNA。
2. PCR擴增：
2.1 實驗設計：
2.1.1待檢樣本檢測：每份樣本分別使用2種反應液（H7和N9反應液）進行檢測，綜合2種反應液的檢測結果對樣本進行判定。
2.2反應體系的配製：
2.2.1準備工作：將2種反應液（H7和N9反應液）融化後振盪混勻，離心6000rpm10秒。
2.2.2 2種反應體系（H7和N9）的配製：取2個1.5ml 無核酸酶離心管，計算待測樣本數量（n），分別取20μl×（n+2）反應液（H7和N9）、0.5μl×（n+2）DNA聚合酶和0.5μl×（n+2）逆轉錄酶充分混勻，離心6000rpm 10秒。
2.3反應體系分管：
每份待測樣本設置2個PCR擴增管（H7和N9），分別將每種反應體系按20μl/管分裝至對應的PCR擴增管中。
2.4加樣：
每份待測樣本RNA、陽性對照、陰性對照以5μl/管分別加入2個PCR擴增管中。
2.5擴增檢測：
將加樣後的PCR擴增管分別轉移到全自動熒光定量PCR檢測儀上進行擴增檢測，不同儀器的設置如下：
2.5.1全自動熒光定量PCR檢測儀（RG3000、ABI Prism 7500、ABI Prism 7000型）擴增程序：
對於ABI Prism 7500、ABI Prism 7000型全自動熒光定量PCR檢測儀，熒光信號設置爲：Reporter Dye1：FAM、JOE/VIC，QuencherDye1：NONE，Passive Reference：NONE。其他型號儀器可設置爲FAM和HEX通道。熒光PCR擴增程序的設置見表1。反應總體積爲25μl。
2.5.2 全自動熒光定量PCR儀（Roche LightCycler系列）擴增程序：
3. 結果分析：
3.1本品H7熒光探針的報告熒光爲FAM，N9熒光探針的報告熒光爲FAM，RNP熒光探針的報告熒光爲HEX。所以應選擇FAM通道和HEX通道分析試驗結果。
3.2 基線（Baseline）範圍根據儀器要求設定，目的爲校正背景熒光干擾，終止循環（End）一般設置爲最強樣本出現擴增信號的前3-4個循環。
3.3 閾值線用於判斷樣本是否擴增，應調整使閾值線高於熒光背景和陰性對照的熒光信號，或點擊分析（Analysis）自動獲得。
4. 質量控制：
每次試驗應設置陽性對照和陰性對照，且應符合以下要求，否則試驗結果不成立。
4.1陰性對照無Ct值或Ct值爲0。
4.2 陽性對照Ct值小於30.0。
13 檢驗結果的解釋
1. 在內標RNP結果成立的條件下各種判讀模式如下：
反應液 | 模式1 | 模式2 | 模式3 | 模式4 |
H7 | - | - | + | + |
N9 | - | + | - | + |
RNP | + | + | + | + |
結果判斷 | H7N9亞型禽流感病毒RNA陰性 | H7N9亞型禽流感病毒RNA陰性 | H7N9亞型禽流感病毒RNA陰性 | H7N9亞型禽流感病毒RNA陽性 |
注：在內標RNP結果不成立的條件下視爲檢測異常，應重新採樣檢測。
2. 結果在灰區的樣本需重複試驗：取200μl樣本重新提取RNA（核酸分離試劑盒中裂解液、無水乙醇的用量加倍，其他組分的用量不變）並檢測。複檢結果Ct＜40.0的樣本爲陽性，否則爲陰性。
3. 內標RNP檢測靶物質爲正常人上皮細胞中廣泛存在的核糖核酸酶P（RNase P）的mRNA，用於對樣本中RNA的提取和擴增檢測過程進行有效監控。
如果該份樣本的RNP檢測 Ct值≥33.0，可能爲以下原因：
3.2核酸提取過程異常，導致RNA損失，應重新提取。
14 檢驗方法的侷限性
1.樣本中RNA濃度低於本產品的最低檢出值（100copies/ml）時可能出現假陰性。
2.目前研究顯示，發病後兩日內取樣檢測，病毒RNA檢出率最高，隨發病時間的延長，病毒被清除，病毒核酸的檢出水平迅速下降。因此應在發病後儘早採樣，必要時可採用多部位取樣檢測。臨牀評價應結合其他臨牀症狀和實驗室檢測指標進行判斷。
15 產品性能指標
1.本品可最低檢出100copies/ml稀釋物。
2.本品對季節性流感（H1N1以及H3N2）滅活病毒、B型流感滅活病毒、高致病性禽流感滅活病毒（H5N1）RNA進行檢測，結果爲陰性。
16 注意事項
1.開始檢測前請仔細閱讀本介紹全文，並嚴格按照要求進行操作。
2.實驗室配置和試驗操作請按照《臨牀基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》和《臨牀基因擴增檢驗實驗室工作規範》進行；整個檢測過程應嚴格分區進行：PCR反應體系的配置區；標本處理、加樣區；各區使用的儀器、設備、耗材和工作服應獨立專用。
3.H7N9亞型禽流感爲經呼吸道傳播疾病，應按照相關要求進行。樣本的採集、處理、運輸和保存均存在一定生物危害。樣本的採集、運輸和保存應按照乙類傳染病進行管理；標本的提取必須在生物安全二級實驗室的負壓生物安全櫃中完成；試驗中接觸過標準品和對照品的廢棄物品（如吸頭）、擴增完畢的離心管、標本等應進行無害化處理後方可丟棄。
18 生產企業
企業名稱：北京金豪製藥股份有限公司
生產地址：北京市北京經濟技術開發區運成街7號
註冊地址：北京市北京經濟技術開發區運成街7號1號樓
郵政編碼：100176
電話號碼：010-67878866
傳真號碼：010-67881632
網 址：www.kinghawk828.com
19 醫療器械生產企業許可證編號
京藥監械生產許20050017號