3 注射用紅色諾卡氏菌細胞壁骨架藥典標準
3.1 中文名
3.2 漢語拼音
Zhusheyong Hongse Nuokashijun Xibaobi Gujia
3.3 英文名
Nocardia Rubra Cell Wall Skeleton for Injection
3.4 定義、組成及用途
本品系用紅色諾卡氏菌經發酵、破碎、提取獲得細胞壁骨架（N-CWS），加入適量乳化劑後凍乾製成，主要含該細胞壁的組分黴菌酸、阿拉伯半乳聚糖和黏肽等。不含防腐劑和抗生素。
3.5 1．基本要求
生產和檢定用設施、原材料及輔料、水、器具、動物等應符合“凡例”的有關要求。
3.6 2．製造
3.6.1 2.1 菌種
生產用菌種應符合“生物製品生產檢定用菌毒種管理規程”的有關規定。
3.6.1.1 2.1.1 名稱及來源
採用紅色諾卡氏菌PO-8株。
3.6.1.2 2.1.2 種子批的建立
3.6.1.3 2.1.3 種子批的傳代
主種子批啓開後傳代次數不得超過5代。工作種子批啓開後至生產，傳代不超過5代。
3.6.2 2.1.4 種子批檢定
3.6.2.1 2.1.4.1 生長特性
在營養瓊脂上生長良好，菌落爲紅色至橙紅色。馬鈴薯塊上生長良好，菌落小，隆起，不整齊，紅色至橙紅色。在肉湯培養基中培養7天，液麪邊緣有菌環，紅色至橙紅色，液體應澄清，有顆粒狀菌落沉澱。
3.6.2.2 2.1.4.2 生化反應
3.6.3 2.1.5 菌種保存
主種子批菌種應凍幹保存於8℃以下或20%甘油中低溫保存於-20℃以下。
3.6.4 2.2 原粉
2.2.1 生產用種子
將檢定合格的工作種子批菌種在葡萄糖－酵母浸粉培養基中於26～30℃振盪培養不超過48小時。塗片鏡檢，無污染雜菌者方可用於接種。
2.2.2 生產用培養基
3.6.4.1 2.2.3 培養
在滅菌培養基中接種適量種子液，振盪通氣培養，培養物於對數生長期後期收穫，在培養結束後塗片鏡檢，如發現污染雜菌，應廢棄。
3.6.4.2 2.2.4 收穫
收集培養液，離心收穫溼菌體。
3.6.4.3 2.2.5 破壁及粗提
2.2.5.1 溼菌體加滅菌純化水，採用超聲波或其他經批准的適宜方法破碎菌體。
2.2.5.2 分別加胰蛋白酶－糜蛋白酶和鏈蛋白酶水解16～24小時，離心，獲細胞壁粗提物。
3.6.4.4 2.2.6 提取
3.6.4.5 2.2.7 乾燥研磨
溶媒提取後的細胞壁骨架於60℃減壓乾燥，研磨，獲得的N-CWS原粉置一20℃乾燥保存，有效期爲24個月。
3.6.4.6 2.2.8 原粉檢定
按3.1項進行。
3.6.5 2.3 半成品
3.6.5.1 2.3.1 配製
檢定合格的N-CWS原粉，加入角鯊烯、甘露醇、聚山梨酯80和注射用水乳化成均勻的白色混懸液，經除菌過濾後供灌裝。根據所測阿拉伯糖含量，使每瓶含N-CWS 200μg。
3.6.5.2 2.3.2 檢定
按3.2項進行。
3.6.6 2.4 成品
3.6.6.1 2.4.1 分批
3.6.6.2 2.4.2 分裝及凍幹
應符合“生物製品分裝和凍幹規程”及2010年版藥典三部附錄Ⅰ A 有關規定。
3.6.6.3 2.4.3 規格
每瓶含N-CWS 200μg。
3.6.6.4 2.4.4 包裝
應符合“生物製品包裝規程”及2010年版藥典三部附錄Ⅰ A 有關規定。
3.7 3．檢定
3.7.1 3.1 原粉檢定
3.7.1.1 3.1.1 外觀
應爲類白色粉末，不溶於水與有機溶劑。
3.7.1.2 3.1.2 定性檢定
取本品適量，按3.3.1項進行。
3.7.1.3 3.1.3 乾燥失重
取本品50mg，在105℃乾燥至恆重，減失重量應不高於5%（2010年版藥典三部附錄Ⅶ L）。
3.7.1.4 3.1.4 微生物限度
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅻ G），應符合規定。
3.7.2 3.2 半成品檢定
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅻ A），應符合規定。
3.7.3 3.3 成品檢定
3.7.3.1 3.3.1 鑑別試驗
3.3.1.1 細胞壁糖
取本品1瓶，加純化水1.0ml，溶解後吸取0.5ml於試管中，滴加0.05%蒽酮硫酸溶液1.0ml，搖勻即呈黃綠色至藍綠色。
取二氨基庚二酸、丙氨酸適量，分別加入50%乙醇配製成0.05mg/ml二氨基庚二酸對照品溶液和0.1mg/ml丙氨酸對照品溶液。取本品5瓶，混合，加6mol/L的鹽酸溶液0.5ml，密封，在蒸氣滅菌器中120℃水解3～6小時，水解液蒸乾，殘渣加50%乙醇1ml使溶解，作爲供試品溶液。
照薄層色譜法（2010年版藥典二部附錄Ⅴ B）取丙氨酸對照品溶液和供試品溶液各2μl，以正丁醇－冰醋酸－水（8：3：1）爲展開劑，取二氨基庚二酸對照品溶液和供試品溶液各5μl，以十二烷基硫酸鈉－正丁醇－正己烷－水（6：25：6：20）爲展開劑，分別點樣於硅膠G薄層板上，展開，取出，晾乾，噴以茚三酮試液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液所顯主斑點的位置和顏色應與對照品溶液主斑點一致。
3.7.3.2 3.3.2 物理檢查
3.3.2.1 外觀爲白色疏鬆體。復溶後應成白色均勻的混懸液。
3.3.2.2 復溶時間
加入注射用水後，復溶時間應不超過1分鐘。
3.3.2.3 可見異物
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅴ B），應符合規定。
3.3.2.4 裝量差異
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅰ A），應符合規定。
3.7.3.3 3.3.3 化學檢定
3.3.3.1 pH值
應爲5.0～7.0（2010年版藥典三部附錄Ⅴ A）。
3.3.3.2 水分
應不高於3.0%（2010年版藥典三部附錄Ⅶ D）。
精密稱取甲醇1g、三氯甲烷0.1g，同置於5ml容量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，再加適量水製成每1ml中約含甲醇20μg、氯仿2μg的混合溶液，精密量取混合液3.0ml置10ml頂空瓶中作爲對照品溶液。取本品10瓶，分別精密加入3.0ml水使溶解，混合，搖勻，精密量取3.0ml置10ml頂空瓶中作爲供試品溶液。照殘留溶劑測定法（2010年版藥典二部附錄ⅥV），以6%氰丙基苯基－94%二甲基聚硅氧烷爲固定液（或極性相近）的毛細管柱爲色譜柱，起始溫度爲40℃，維持11分鐘，再以每分鐘25℃的速率升溫至180℃，維持6分鐘，進樣口溫度180℃，檢測器溫度220℃，頂空瓶平衡溫度爲70℃，平衡時間爲30分鐘。取對照品和供試品溶液氣液平衡後的液上氣體500μl，分別注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峯面積計算，甲醇殘留量應不高於0.2%，三氯甲烷殘留量應不高於0.003%。
3.3.3.4 聚山梨酯80含量測定
取本品10瓶，分別加入適量純化水，溶解並稀釋至100ml，精密量取1.0ml，按聚山梨酯80殘留量測定法（2010年版藥典二部附錄Ⅵ H）進行測定，每瓶含聚山梨酯80應小於1mg。
3.7.3.4 3.3.4 無菌檢查
依法檢查（2010年版藥典二部附錄Ⅻ A），應符合規定。
3.7.3.5 3.3.5 異常毒性檢查
依法檢查（2010年版藥典二部附錄Ⅻ F），應符合規定。
3.7.3.6 3.3.6 細胞壁骨架（N-CWS）含量測定
細胞壁骨架（N-CWS）由黴菌酸、阿拉伯半乳聚糖和黏肽等成分組成，其中含33%阿拉伯糖，本檢測是通過測定阿拉伯糖含量推算N-CWS含量。
精密稱取在60℃減壓乾燥1小時的阿拉伯糖和半乳糖（用於排除干擾）適量，分別加純化水製成20mg/ml的溶液。精密量取阿拉伯糖溶液2.5ml和半乳糖溶液1.2ml，置10ml容量瓶中，加相應空白溶液至刻度，搖勻，製成5mg/ml阿拉伯糖的對照品溶液。再精密吸取對照品溶液適量，加純化水稀釋成40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml及120μg/ml的阿拉伯糖系列溶液。以水做空白，精密量取上述系列溶液和水各2.0ml，置具塞試管中，在冰水浴中，分別緩慢滴加2%蒽酮乙酸乙酯溶液0.5ml，濃硫酸4.0ml，小心搖勻，於80℃水浴保溫30分鐘，立即用流水衝冷至室溫，按紫外－可見分光光度法（2010年版藥典二部附錄Ⅱ A）於625nm波長處測定吸光度。以吸光度爲縱座標，以阿拉伯糖濃度爲橫座標，繪製標準曲線。
取供試品10瓶，分別精密加入1.0ml純化水，混合，搖勻，作爲供試品溶液。以水爲空白，精密量取供試品溶液2.0ml，同法於625nm波長處測定吸光度，代人標準曲線。計算供試品溶液中阿拉伯糖含量，阿拉伯糖含量應爲66～104μg/瓶，折算成N-CWS含量應不低於200μg/瓶。
3.7.3.7 3.3.7 抑瘤試驗
將S180腹水瘤細胞與本品混合均勻，皮下接種於實驗小鼠，2周後解剖動物，稱瘤重，計算抑瘤率應不低於50%。
取體重爲18～20gBALB/c小鼠20只，試驗組及對照組各10只，抽取S180腹水瘤，計數後稀釋成2×107個細胞/ml，將N-CWS溶於生理氯化鈉溶液，製成2000μg/ml。取1.0ml瘤細胞與1.0mlN-CWS液混合均勻，做爲試驗組樣品。同時取1.0ml角鯊烯、甘露醇和聚山梨酯80的混合液（與配製半成品時相同的濃度和比例）與1.0ml瘤細胞混合作爲對照組注射用。分別對小鼠皮下注射，每隻0.2ml（200μg N-CWS/只），接種後14天解剖動物，取瘤並稱重，按下式計算抑瘤率。
3.8 4．保存、運輸及有效期
於4～20℃避光保存和運輸。自生產之日起，有效期爲18個月。
3.9 5．使用說明
3.10 版本
《中華人民共和國藥典》（2010年版 第三增補本）