3 凍幹皮內注射用卡介苗製造及檢定規程
3.1 菌種
1.1 製造卡介苗的菌種，應由中國藥品生物製品檢定所分發或經同意。嚴禁使用通過動物的菌種製造卡介苗。
1.2 如果採用次代種子批，單批收穫培養物的總代數不得超過12代（包括在馬鈴薯培養基上培育的代數與在液體蘇通培養基上的代數）。
1.3 菌種檢定
1.3.1 培養特性
卡介菌在蘇通培養基上發育良好。培育溫度在37～39℃之間。抗酸染色應爲抗酸桿菌。在蘇通馬鈴薯培養基上發育的卡介菌應是幹皺成團略呈淺黃色。在牛膽汁馬鈴薯培養基上爲淺灰色粘膏狀菌苔。在雞蛋培養基上有突起的皺型和擴散型兩類菌落，且帶淺黃色。在蘇通培養基上卡介菌應浮於表面，爲多皺微帶黃色的菌膜。
1.3.2毒力試驗
用結素試驗（PPD 100IU）陰性，體重300～400g的同性健康豚鼠4只，各腹腔注射1ml菌液（5mg/ml），每週稱體重，4～5周後解剖檢查，大網膜上可出現膿皰，腸繫膜淋巴結及脾可能腫大，肝及其他臟器應無肉眼可見的病變。
1.3.3 毒力試驗
用結素試驗（PPD 100IU）陰性，體重300～400g的同性健康豚鼠6只，於肌內側皮下各注射1ml菌液（10mg/ml），注射前稱體重，注射後每週觀察1次注射部位及局部淋巴結的變化。每2周稱體重1次。6周時解剖3只，滿3個月將另3只豚鼠解劑，檢查各臟器應無肉眼可見的結核病變。若有可疑病竈時，應作塗片和組織切片檢查，並採取部分病竈磨碎，加少量生理鹽水混勻，皮下注射2只豚鼠。若證明系結核病變，該菌種即應廢棄。試驗經過詳細記錄備查。若未滿3個月試驗豚鼠因其他病患死亡應解剖檢查，依上法處理。若死亡2只以上應重試。
1.3.4免疫力試驗
用原代種子批以1/100人份的劑量免疫豚鼠，以103～104強毒人型結核分枝桿菌感染，免疫組與對照組動物的病變指數及脾臟毒菌分離數的對數值經統計學處理，應有顯著差異。如無條件，可送中國藥品生物製品檢定所進行。
3.2 菌苗製造
2.1 卡介苗製造室必須與其他生物製品部門及實驗室分開。所需用具如高壓鍋、冰箱及玻璃器皿等，均須單獨設置並專用。卡介苗製造、包裝及保存過程均須避光。
卡介苗製造的工作人員及經常進入卡介苗製造室的人員，必須身體健康，經X線檢查無結核病，且以後每年經X線檢查1～2次，可疑者暫不在卡介苗製造室工作，其檢查記錄必須保存備查。
生產用培養基不得含有能使人產生毒性或變態反應的物質。培養基所用的原料應符合《中國生物製品主要原材料試行標準》規定。
凍幹菌種在蘇通馬鈴薯培養基、膽汁馬鈴薯培養基以及液體蘇通培養基上每傳一次爲一代。馬鈴薯培養基上培育的菌種放冰箱保存不超過2個月。用於生產菌苗的培養物的總代數不超過12代。
2.4.1 收集
培養瓶應逐瓶檢查，若有污染、溼膜、混濁等情況應廢棄。收集菌膜壓幹，移入盛有不鏽鋼珠瓶內，鋼珠與菌體的比例應根據研磨機轉速控制在一適宜的範圍，並儘可能在低溫下研磨。加入適量無致敏原保護液稀釋成一定濃度的原液。
2.4.2 稀釋
用中國藥品生物製品檢定所發給的凍幹卡介苗參考比濁標準，以分光光度法或其他適宜方法測定原液濃度，用保護液將原液稀釋成1.0mg/ml。
2.4.3 純菌試驗
用於製造卡介苗的培養物、原液、以及稀釋後的菌苗均應按《生物製品無菌試驗規程》抽樣做純菌試驗。
2.5 菌苗分批
用同一代菌種同時製造的菌苗爲1批，稀釋爲數瓶者，按瓶分亞批。
2.6 分裝
分裝過程中勿使苗混合均勻。每10人份卡介苗應爲0.5±0.1mg。
3.3 凍幹
菌苗原液分裝後應立即進行凍幹。乾燥完畢後立即進行真空封口。亦可充氮封口。
3.4 成品檢定
凍幹卡介苗應爲白色疏鬆體或粉末狀。加入稀釋液後，應於3分鐘內完全溶解成均勻懸液。殘餘水分不應超過3%。包裝前應每支安瓿檢查真空，不合格的安瓿應廢棄。
4.2 鑑別試驗
4.3 純菌試驗
每亞批菌苗抽樣按《生物製品無菌試驗規程》進行。
4.4 活菌計數
同一代菌種製造的各批凍幹卡介苗應抽1批做幹前活菌計數。同一批菌種製造的各亞批菌苗均應做幹後活菌計數，抽安瓿5支稀釋混合。凍幹菌苗活菌數應在100萬/mg以上。可與熱穩定性試驗同時進行。
4.5 熱穩定性試驗
取凍幹後菌苗放置37℃28天進行加速失活試驗，測定活菌數，與4℃保存的同一批菌苗同時進行比較，計算降低的百分離。加溫放置製品的活菌數應不少於冷藏菌苗的2%，但不得低於20萬/mg。此試驗可與參考菌苗同時進行（參考菌苗加入試驗的目的爲檢查培養基的質量）。每一機櫃凍幹菌勒應抽樣進行此項試驗。
4.6 安全試驗
同一代菌種生產的各批凍幹卡介苗應抽1個亞批做安全試驗。用結素試驗（PPd 10IU）陰性，體重300～400g的同性健康豚鼠6只。每隻皮下注射相當於50人份的凍幹皮內注射用卡介苗，每2周稱重一次，觀察6周後，解剖檢查每隻動物，若肝、脾、肺等臟器無結核病變，該批菌苗即可發出使用。若有可疑病竈時，應按1.3.3項處理。
3.5 保存與效期
4 凍幹皮內注射用卡介苗使用說明書
嚴禁皮下或肌內注射
本品爲白色疏鬆體或粉末，按規定量加入稀釋液後，應於3分鐘內完全溶解成均勻懸液。
4.1 接種對象
出生3個月以內的嬰兒或用5IUPPD或5IU稀釋舊結核菌素試驗陰性的兒童（PPD或結素試驗後48～72小時局部硬結在5mm以下者爲陰性）。
4.2 用法
1.菌苗稀釋
用滅菌的1ml注射器將隨製品附發的稀釋液定量加入凍幹皮內注射用卡介苗安瓿中（）稀釋液應有足夠的附加量，以保證吸出量與標示量一致），放置約1分鐘，搖動安瓿使之溶化後，用注射器來回抽取數次，使充分混勻，每支安瓿自稀釋時起，必須在半小時內用守，以防污染。
2.接種方法
先用75%酒精消毒上臂外側三角肌中部略下處的皮膚，然後用滅菌的1ml藍心注射器（25～26號針頭）吸取搖勻的菌苗，皮內注射0.1ml。
4.3 反應
接種後2周左右，局部可出現紅腫浸潤，若隨後化膿，形成小潰瘍，可用1%龍膽紫塗抹，以防感染。一般8～12周後結痂，如遇局部淋巴結腫大可用熱敷處理，如已軟化形成膿皰，可用滅菌注射器抽膿。如已穿孔，則請醫生檢查，可用10%磺胺軟膏或20%對氨基柳酸軟膏處理。
4.4 禁忌
凡患有結核病、急性傳染病、腎炎、心臟病、溼疹、免疫缺陷症或其他皮膚病者均不予接種。
4.5 注意事項
1.安瓿有裂紋和過期失效者不可使用。
2.接種對象必須詳細登記姓名、性別、年齡、住址、菌苗批號及亞批號、製造單位和接種日期。
3.接種卡介苗的注射器應專用，不得用作其他注射，以防止產生化膿反應。
4.使用時製品注意避光。
4.6 保存
保存於2～8℃暗處。
5 參考資料
- ^ [1] ．"《中國生物製品規程》"．