2 註解
本法系用高效液相色譜法測定維生素D(包括維生素D<[2]>和D<[3]>,下同)及其製劑、維生素AD製劑或魚肝油中所含維生素D及前維生素D經摺算成維生素D的總量，以單位表示，每單位相當於維生素D0.025μg。
測定應在半暗室中及避免氧化的情況下進行。
無維生素A醇及其他雜質干擾的供試品可用第一法測定，否則應按第二法處理後測 定；如果按第二法處理後，前維生素D峯仍受雜質干擾，僅有維生素D峯可以分離時，則應按第三法測定。
2.1 第一法
對照品貯備溶液的製備
根據各製劑中所含維生素D的成分,精密稱取相應的維生素D<[2]>或D<[3]>對照品25mg,置100ml棕色量瓶中，加異辛烷80ml，避免加熱，用超聲處理助溶1分鐘使完全溶解，加異辛烷至刻度，搖勻，充氮密塞，避光，0℃以下保存。
測定維生素D<[2]>時，應另取維生素D<[3]>對照品25mg，同法制成維生素D<[3]>對照品貯備溶液，供系統適用性試驗用。
內標溶液的製備
稱取鄰苯二甲酸二甲酯25mg，置25ml量瓶中，加正己烷至刻度，搖勻。
色譜條件與系統適用性試驗
用硅膠爲填充劑，正己烷－正戊醇（997∶3）爲流動相，檢測波長爲254nm。量取維生素D<[3]>對照品貯備溶液5ml，置具塞玻璃容器中，通氮後密塞，置90℃水浴中加熱1小時，取出迅速冷卻，加正己烷5ml， 搖勻，置1cm具塞石英吸收池中，在2支8W主波長分別爲254和365nm的紫外光燈下， 將石英吸收池斜放成45°,並距燈管5～6cm,照射5分鐘,使溶液中含有前維生素D<[3]>、反式維生素D<[3]>、維生素D<[3]>和速甾醇D<[3]>；取此溶液注入液相色譜儀，測定維生素D<[3]>的峯值，先後進樣5次,相對標準偏差應不大於2.0％；前維生素D<[3]>(與維生素D<[3]>的比保留時間約爲0.5)與反式維生素D<[3]>(與維生素D<[3]>的比保留時間約爲 0.6)以及維生素D<[3]>與速甾醇D<[3]>(與維生素D<[3]>的比保留時間約爲1.1)的峯分離度均應大於1.0。
校正因子測定
精密量取對照品貯備溶液和內標溶液各5ml,置50ml量瓶中，加正己烷至刻度，搖勻；取一定量注入液相色譜儀，計算維生素D的校正因子f<[1]>。
另精密量取對照品貯備溶液5ml置50ml量瓶中，加入2,6－二叔丁基對甲酚結晶1粒,通氮排除空氣後，密塞，置90℃水浴中加熱1．5小時，取出迅速冷卻至室溫，精密加內標溶液5ml，加正己烷至刻度，搖勻；取一定量注入液相色譜儀，計算前維生素D折算成維生素D的校正因子f<[2]>。
f<[2]>＝(A<[s]>·m<[r]>－f<[1]>m<[s]>A<[r1]>)／A<[r2]>·m<[s]>
式中
A<[s]>爲內標的峯值；
m<[r]>爲加入對照品的量；
f<[1]>爲維生素D的校正因子；
m<[s]>爲加入內標物質的量；
A<[r1]>爲維生素D的峯值；
A<[r2]>爲前維生素D的峯值。
含量測定
取各該製劑項下製備的供試品溶液進行測定,按下列公式計算維生素D及前維生素D折算成維生素D的總量。
mi＝(f<[1]>·A<[i1]>＋f<[2]>A<[i2]>)·m<[s]>／A<[s]>
式中
A<[i1]>爲維生素D的峯值；
A<[i2]>爲前維生素D的峯值；
m<[s]>爲加入內標物質的量；
A<[s]>爲內標的峯值。
2.2 第二法
精密稱取供試品適量(相當於維生素D總量600單位以上，重量不超過2.0g)，置皂化瓶中，加乙醇30ml、抗壞血酸0.2g與50％(g／g)氫氧化鉀溶液3ml[若供試量爲3g，則加50％(g／g)氫氧化鉀溶液4ml]，置水浴上加熱迴流30分鐘，冷卻後，自冷凝管頂端加水10ml沖洗冷凝管內壁，將皂化液移至分液漏斗中，皂化瓶用水60～100ml分數次洗滌,洗液併入分液漏斗中，用不含過氧化物的乙醚振搖提取3次，第一次60ml,以後每次40ml，合併乙醚液，用水洗滌數次，每次約100ml，洗滌時應緩緩旋動，避免乳化,直至水層遇酚酞指示液不再顯紅色，靜置，分取乙醚提取液，加入乾燥濾紙條少許振搖除去乙醚提取液中殘留的水分，分液漏斗及濾紙條再用少量乙醚洗滌，洗液與提取液合併，置具塞圓底燒瓶中，在水浴上低溫蒸發至約5ml，再用氮氣流吹乾，迅速精密加入甲醇3ml，密塞，超聲處理助溶後，移入離心管中，離心，取上清液作爲供試品溶液A。
精密量取上述供試品溶液A 500μl,注入以十八烷基硅烷鍵合硅膠爲填充劑的液相色譜柱，以甲醇－乙腈－水(50∶50∶2) 爲流動相進行分離，檢測波長爲254nm，從計錄儀上觀察色譜圖，要求維生素D與前維生素D爲疊 峯，並能與維生素A及其他干擾含量測定的雜質分開；準確收集含有維生素D及前維生素D混合物的全部流出液，置具塞圓底燒瓶中，用氮氣流迅速吹乾,精密加入已知內標濃度的正己烷溶液適量(不少於2ml，並使每1ml中含維生素D爲50～140單位,內標物質與維生素D的重量比約爲4∶1)，密塞，超聲處理助溶，即爲供試品溶液B。
取供試品溶液B，按第一法進行含量測定，進樣量爲100～200μl。
2.3 第三法
供試品溶液的製備
取各該製劑項下製備的供試品溶液A,按上述第二法淨化用色譜柱系統分離維生素D項下的方法處理,至“用氮氣流迅速吹乾”後, 加入異辛烷2ml溶解,通氮排除空氣後，密塞，置90℃水浴中，加熱1.5小時後，立即通氮在2分鐘內吹幹，迅速精密加入正己烷2ml，溶解後，即爲供試品溶液C。
對照品溶液的製備
精密量取對照品貯備溶液適量,加異辛烷定量稀釋製成每1ml中約含維生素D 50單位，精密量取2ml置具塞圓底燒瓶中，照供試品溶液製備項下的方法,自“通氮排除空氣後”起，依法操作，得對照品溶液。
含量測定