3 人用濃縮狂犬病疫苗製造及檢定規程
3.1 毒種
1.1 毒種來源
狂犬病固定毒aG適應株系用狂犬病固定毒北京株先在地鼠腎細胞傳代適應後，再通過豚鼠腦內交替傳代適應而成。由中國藥品生物製品檢定所檢定、保存與分發。生產用毒種傳代應不超過10aG交替代。
1.2 毒種檢定
1.2.1無菌試驗
aG毒種用體重11～13g小白鼠進行腦內病毒滴定，滴度≥8.0LogLD50/1.0ml方可用於生產。
1.2.3純毒試驗
生產前和生產末期用小白鼠做腦內法中和試驗，以鑑定毒種的特異性。所用特異性抗血清由中國藥品生物製品檢定所提供。中和指數必須在500以上。生產過程中如對毒種發生疑問，應及時進行鑑定。
1.3 毒種傳代
選擇體重120～160g健康豚鼠，腦內注射，選潛伏期80～100小時具有典型狂犬病症狀者放血致死，無菌取腦。豚鼠腦連續傳代不超過5代。
1.4 毒種保存
供生產用aG株在-60℃以下保存，不得超過1年。
3.2 疫苗製造
2.1 細胞製備
2.1.1地鼠
選用12～14日齡健康地鼠，如腹腔有充血、滲出液、腎臟異常等應廢棄。
2.1.2解剖
處死地鼠，用消毒液洗滌皮毛數次，末次浸泡一定時間，無菌取腎，置於瓶中剪碎。
將剪碎腎塊洗滌數次，加入適量胰蛋白酶消化液，置2～8℃過夜（約16～20小時）或37℃水浴消化適當時間，棄去消化液，經洗液洗滌2～3次，振搖或吹打分散細胞，加入適量生長液，分裝培養瓶，置37℃±0.5℃培養長成單層。
2.1.4使用液體
2.1.4.1生長液
爲含不超過10%小牛血清水解乳蛋白SMI液或其他適宜培養液，可加入適量抗生素。
2.1.4.2浸泡液
爲水解乳蛋白SMI液或其他適宜培養液，其中保護劑可選用0.1%以上人白蛋白，可加入適量抗生素。
2.1.4.3維持液
爲199或其他適宜的溶液，其中保護劑中可選用0.4%以上人白蛋白，可加入適量抗生素。
每生產批細胞留5%（或不少於500ml）懸液作爲對照細胞檢查外源病毒。該細胞除不接種病毒外，細胞濃度和處理均與生產過程平行進行。至原液收穫之日用顯微鏡觀察，應無病變發生。並用0.2%～0.5%豚鼠紅細胞（4℃保存不超過7天）進行血吸附試驗，置4～8℃30分鐘判定結果；再置20～25℃30分鐘再次判定結果，均應爲陰性。如有可疑病變或血吸附可疑陽性，在同種細胞上繼續盲傳，如傳出病毒，該批細胞製備的疫苗應予廢棄。
2.2.1病毒接種
將長成單層細胞瓶傾去營養液，換入浸泡液。同時將無菌試驗合格的aG株搖碎後，經1000r/min離心10分鐘，吸取上清液按1∶1000～1∶4000種入細胞瓶，也可將細胞與病毒同時接種，置32～37℃繼續培養。
2.2.2洗換
種毒後吸附適當時間傾去浸泡液，用Hanks液或其他適宜液體洗滌細胞，然後換入維持液，置32～37℃繼續培育。
2.2.3病毒液收穫
洗換後觀察細胞生長情況，選擇適當天數收穫病毒液，取樣品做病毒滴定及無菌試驗。
將樣品做10倍系列稀釋，取3個稀釋度的病毒液，每個稀釋度用體重11～13g小白鼠4只，每隻腦內接種0.03ml，逐日觀察，14日判定結果，計算LD50（3日內死亡者不計）。滴度要求在5.5LogLD50/1.0ml以上。可重試1次。
2.3 滅活
病毒液內加入1/4000～1/5000的甲醛溶液，置32～37℃或2～8℃或其他適宜溫度滅活一定時間。
2.4 過濾合併
2.5 防腐劑
按0.005%～0.01%加入硫柳汞。
2.6 超濾濃縮
原液按其滴度進行不同倍數濃縮。按《生物製品無菌試驗規程》進行無菌試驗。
3.3 疫苗劑型
3.1 液體濃縮疫苗
病毒液滅活經超濾濃縮後再加入Al（OH）3，使最終含量爲0.4～ 0.7mg/ml。
3.2 凍幹濃縮疫苗
3.2.1凍幹保護劑
3.2.2疫苗稀釋
將保護劑按比例加入疫苗內，充分搖勻，取樣做凍幹前無菌試驗後立即分裝與凍幹。
3.4 半成品檢定
4.1 無菌試驗
按《生物製品無菌試驗規程》進行。
4.2 滅活試驗
將樣品腦內接種體重11～13g小白鼠10只，每隻0.03ml，觀察14天，應健存，非特異死亡不超過20%。小白鼠如發病死亡，可繼續滅活並進行滅活試驗。
用檢定所認可的試劑和方法測定，液體濃縮疫苗與凍幹濃縮疫苗牛血清蛋白含量應≤50ng/ml。
3.5 分裝
半成品檢定合格後即可進行分裝。液體濃縮疫苗每支裝量2ml，凍幹濃縮疫苗每支裝量1ml或2ml。
3.6 成品檢定
6.1 效力試驗
由質量檢定部門進行。
6.1.1攻擊毒株
攻擊毒株（CVS）由中國藥品生物製品檢定所發給。
6.1.2擊毒株的製備
6.1.2.1啓開凍幹毒種：稀釋成10-2懸液，用體重11～13g小白鼠，腦內接種0.03ml，連續傳2～3代，收腦時應選擇4～5天有典型狂病症狀的腦組織，放-60℃低溫保存。
6.1.2.2病毒懸液的製備：將鼠腦研磨並加入適量正常馬血清或小牛血清蒸餾水，製成20%懸液，經1000r/min沉澱10分鐘，吸取上清液分裝安瓿或小管，儲存於-60℃冰箱中，經用體重18～20g小白鼠做病毒滴定，符合要求後，方可作攻擊毒用。
6.1.3疫苗參考對照品。
由檢定所定期發給。
6.1.4待檢疫苗
取同批安全試驗合格疫苗用pH7.6PBS做5倍連續稀釋，一般採用3個稀釋度以上進行免疫，如1∶5、1∶25、1∶125的稀釋度。
6.1.5免疫
選用體重12～14g的小白鼠，免疫時應同時有參考對照品的對照和攻擊病毒LD50測定的對照小白鼠，參考對照品可做1∶25、1∶125和1∶625共3個稀釋度進行免疫，每隻小白鼠腹腔注射0.5ml，間隔一週再免疫一次，免疫時將疫苗保存在冰浴中，各組小白鼠都應在同樣的條件下飼養。
6.1.6攻擊
小白鼠於第一次免疫後14天，用預先測定含5～100個LD50的病毒量腦內攻擊0.03ml/只。病毒測定用10-0、10-1、10-2、10-3，每稀釋度不少於8只，疫苗免疫組小白鼠每個稀釋度爲14～16只，所有小白鼠自攻擊之日起觀察14天。第5天后死亡和呈現典型腦病症狀也作爲因狂犬病死亡而計算在內。
6.1.7判定結果和合格指標
要求原病毒懸液注射的小白鼠80%以上死亡，攻擊病毒含量爲5～100個LD50。液體濃縮疫苗合格指標應≥2.5IU/安瓿（2ml），凍幹濃縮疫苗應≥2.5IU/安瓿（1ml或2ml）。疫苗不合格可複試一次。
6.2 物理檢查
液體濃縮疫苗應爲橘紅-紫紅色混濁液體，久放形成可搖散的沉澱。凍幹濃縮疫苗爲淡黃色疏鬆體。
6.3 化學測定
按《生物製品化學檢定規程》進行。
6.3.1 pH值
pH值應爲7.2～8.0。
6.3.2氫氧化鋁含量
不得超過0.7mg/ml。
6.3.3硫柳汞含量
不得超過0.01%。
6.3.4遊離甲醛含量
不得超過0.015%。
6.3.5水分
6.4 無菌試驗
按《生物製品無菌試驗規程》進行。
6.5 毒性試驗
取疫苗接種11～13g小白鼠10只，每隻腹腔注射0.5ml，觀察7天，應健存。
6.6 稀釋液
凍幹濃縮疫苗用滅菌注射用水或其他適宜稀釋液稀釋，其質量應符合《中國藥典》規定。
3.7 保存與效期
4 人用濃縮狂犬病疫苗使用說明書
本疫苗爲狂犬病固定毒（aG）適應株，接種於原代地鼠腎單層細胞，培養後收穫病毒液，加入甲醛溶液滅活後濃縮，再加氫氧化鋁製成。用於預防狂犬病。
液體濃縮疫苗爲橘紅色-紫紅色微混濁液體，久放形成可搖散的沉澱。凍幹濃縮疫苗爲淡黃色疏鬆體。含硫柳汞防腐劑。
4.1 別名
4.2 接種對象
凡被狂犬或其他瘋動物咬傷、抓傷時，應立即處理局部傷口（用肥皂水反覆沖洗後，再用碘酊消毒數次），並及時注射本疫苗。
4.3 用法
1.一般咬傷者於0（第1天，注射當天）、3（第4天，以下類推）、7、14、30天各注射本疫苗1安瓿（液體疫苗2ml，凍幹疫苗1ml或2ml），兒童用量相同。嚴重咬傷者（頭、面頸、手指、多部位3處以上咬傷，咬穿皮膚或舔觸粘膜者），應按上述方法注射本疫苗。並應於0、3天注射加倍量疫苗，並於0天注射疫苗的同時用抗狂犬病血清（40IU/kg）或狂犬病免疫球蛋白（20IU/kg）浸潤咬傷局部和肌內注射。凡聯合使用抗狂犬病血清或免疫球蛋白者，必須在全程疫苗注射完畢後再加強注射2～3針疫苗，即在全程注射後第15、75天或第10、20、90天加強。
2.本疫苗供上臂三角肌肌內注射。兒童應在大腿前內側區肌內注射。
3.使用前將疫苗振搖成均勻懸液。凍幹濃縮疫苗則加入等量滅菌注射用水溶解後，以無菌手續將疫苗吸入注射器內。
4.對未咬傷健康者預防注射，可按0、7、21天注射3針。
4.4 禁忌
4.5 注意事項
1.注射疫苗期間可照常工作，切忌飲酒、濃茶等刺激性食物及劇烈勞動等，以避免引起反應。
2.傷口不宜包紮或縫合。
4.6 保存
應保存於2～8℃。
5 參考資料
- ^ [1] ．"《中國生物製品規程》"．