2 註解
工具酶是基因重組技術不可缺少的工具。主要有限制性內切酶、連接酶、核酸聚合酶、逆轉錄酶、核酸酶等。
限制性內切酶有Ⅰ型和Ⅱ型限制性DNA內切酶之分，Ⅱ型能嚴格識別核酸序列，並在識別區內特定的核苷酸處切開DNA雙鏈。故通常所指都是Ⅱ型限制性DNA內切酶。識別分四核苷酸和六核苷酸，其序列旋轉對稱。切口分開端和粘端，產生3′－OH和5′－P末端。內切酶品種多，使用時應注意溫度、緩衝液用量（一般1μg DNA/2-5單位酶）等反應條件。
連接酶有T4噬菌體DNA連接酶、T4噬菌體RNA連接酶、大腸埃希菌DNA連接酶等。DNA連接酶可連接平端，也連接粘端。反應需有Mg2 和ATP存在，pH7.5-7.6。最適溫度37℃，30℃以下活性明顯下降，但考慮到被連接DNa 的穩定性和粘性末端的退火溫度，一般平端連接用20-25℃，粘端連接用12℃左右。
聚合酶有DNA聚合酶（以DNA爲模板合成DNA大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ，大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow大片段），T4或T7噬菌體DNA聚合酶等）；RNA聚合酶（以DNA爲模板合成RNA，T7或T3噬菌體RNA聚合酶）；逆轉錄酶（以RNA爲模板合成DNA，除RNA病毒中發現外，發現大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ和Taq DNA聚合酶都有逆轉錄活性）。
大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ具有5′→3′聚合酶活性和5′→3′，3′→5′外切酶活性。Klenow片段是DNA聚合酶Ⅰ被枯草桿菌酶作用產生的一個大片段，有5′→3′聚合酶和5′→3′外切酶活性，無3′→5′外切酶活性。可用於缺口翻譯（Nick translation）法標記核酸，也可用於DNA序列測定，修補DNA鏈等。
核酸酶有DNase、RNase、核酸酶S1等，可水解相應的DNA和RNA，核酸酶S1可降解單鏈DNA和RNA，用量增大也可降解雙鏈核酸。它可用於切去ds-cDNA合成中產生的髮夾環。
末端轉移酶在Mg2 存在下，選擇3′－OH端單鏈DNA爲引物加成核苷酸，在Co2 存在下，選擇3′－OH端雙鏈DNA爲引物加成核苷酸，形成多聚核苷酸尾。常用於核酸末端標記和核酸連接的互補多聚尾（連接器）。
鹼性磷酸酶去除5′－P，可防止二分子DNA片段5′端P基團自身空間障礙，影響DNA分子之間的連接，一般用鹼性磷酸酶處理載體DNA除去5′端P基團，在連接酶作用下目的基因的5′端P先與載體3′端OH連接，再通過複製修復另一條鏈，使二條鏈完全連接。該方法大大提高了連接效率。