2 英文參考
Blood—Determination of free erythrocyte protoporphyrin—Fluorometric method
中華人民共和國衛生行業標準WS/T 22—1996《血中游離原卟啉的熒光光度測定方法》(Blood—Determination of free erythrocyte protoporphyrin—Fluorometric method)由中華人民共和國衛生部於1996年10月14日發佈,自1997年05月01日起實施。
5 3 儀器
3.2 旋渦混合器。
3.3 離心機。
3.4 1/10萬天平。
3.5 刻度吸量管,1,2,5,10 mL。
3.6 血紅蛋白吸管。
3.7 試管,10 mL,具塞。
3.8 微型稱量瓶。
3.9 容量瓶,25 mL,50 mL。
3.10 水泵。
6 4 試劑
本標準所用試劑除另有說明者外,均爲分析純試劑。
4.2 鹽酸,ρ20=1.19 g/mL。
4.6 硅藻土生理鹽水懸浮液,25 g/L。
4.7.1 儲備液:用十萬分之一的天平精確稱取1.25 mg原卟啉,加濃鹽酸約2.5 mL,待原卟啉溶解後,轉入25 mL容量瓶中,用重蒸水淋洗稱量瓶,併入容量瓶中,並稀釋至刻度。此溶液1 mL=50 μg原卟啉(如爲原卟啉鈉鹽或原卟啉二甲基酯則分別應稱取1.35 mg和1.28 mg)。
4.7.2 應用液;取儲備液0.1 mL置50 mL容量瓶中,用乙酸乙酯-乙酸混合液稀釋至刻度。此溶液1 mL= 0.1μg原卟啉。
4.8 質控樣:用標準血樣、接觸者混合血樣或加標血樣作質控樣。
8 6 分析步驟
8.1 6.1 儀器操作條件
選用42#(581光電比色計濾光片,420 nm)爲激發光濾光片和55# (550±10 nm)熒光濾光片。
8.2 6.2 標準曲線的繪製
6.2.1 取6支10 mL具塞試管,按下表配製標準管。
FEP標準管的配製
管號 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
生理鹽水(4.5),mL | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
原卟啉標準應用液(4.7.2),mL | 0 | 0.1 | 0.3 | 0.5 | 0.7 | 1.0 |
1.0 | 0.9 | 0.2 | 0.5 | 0.3 | 0 | |
FEP含量,μg | 0 | 0.01 | 0.03 | 0.05 | 0.07 | 0.10 |
6.2.2 各管混合均勻後,各加0.15 mL 2.5%硅藻土懸浮液(4.6),3 mL乙酸乙酯-乙酸混合液(4.3)。
6.2.3 各管分別置旋渦混合器上混合10~15 s(或振盪30 s)後,於2000 r/min離心15 min,將上清液分別倒入另一清潔的10 mL具塞試管中,各加4 mL 9.5 mol/L鹽酸(4.4),加塞,予旋渦混合器上混合20~30 s(或振盪3 min),待分層後,用水泵(或毛細吸管)吸去上層有機溶劑,取下層鹽酸溶液於熒光光度計上以零管作參比進行熒光強度測定。
6.2.4 以FEP含量爲橫座標,熒光強度爲縱座標繪製標準曲線。
8.3 6.3 樣品測定
將血樣從冰箱中取出,搖勻,加1.0 mL乙酸乙酯-乙酸混合液(4.3),以下步驟按6.2.2和6.2.3條操作,從標準曲線上查出血樣中FEP含量。在測定前後及每測定10個樣品後,作一次質控樣測定。
10 8 說明
8.1 本標準的最低檢測濃度爲5 μg/100 mL血;測定範圍0.001~0.1μg FEP/20 μL,批間精密度cv=4.3%~7.0%,批內精密度CV=2.4%~5.3%(FEP範圍0.01~0.1μg,n=6);準確度;血樣加標平均回收率爲96.6%(加標濃度:0.03,0.05,0.07μg,n=6)。
8.2 用熒光法測定血中FEP,經用正交試驗進行最佳測定條件選擇,得出最佳條件是:鹽酸的濃度爲0.5 mol/L,乙酸乙酯-乙酸的比例爲4+1,硅藻土懸浮液用量爲0.15 mL,振搖時間爲5 min,現改用旋渦混勻器可減少爲20~30 s。全過程在30 min內完成。
8.3 本法與熒光分光光度法對比,96個樣本測得結果的相關係數r=0.9796,tr=47.02,p<0.001,提示相關係數有非常顯著意義。但當血中FEP值低於20μg/100 mL時,熒光分光光度法的靈敏度高。本法應用於接觸者(一般FEP>50μg/100 mL)的監測是不受影響的。