GBZ/T 240.8—2011 化學品毒理學評價程序和試驗方法 第8部分：鼠傷寒沙門氏菌回覆突變試驗

1 拼音

GBZ/T 240.8—2011 huà xué pǐn dú lǐ xué píng jià chéng xù hé shì yàn fāng fǎ dì 8bù fēn ：shǔ shāng hán shā mén shì jūn huí fù tū biàn shì yàn

2 英文參考

Procedures and tests for toxicological evaluations of chemicals—Part 8:Salmonella typhimurium reverse mutation assay

ICS 13.100

C 52

中華人民共和國國家職業衛生標準 GBZ/T 240.8—2011《化學品毒理學評價程序和試驗方法 第8部分：鼠傷寒沙門氏菌回覆突變試驗》（Procedures and tests for toxicological evaluations of chemicals—Part 8:Salmonella typhimurium reverse mutation assay）由中華人民共和國衛生部2011年08月19日發佈，自2012年03月01日起實施。

3 前言

根據《中華人民共和國職業病防治法》制定本部分。

GBZ/T 240《化學品毒理學評價程序和試驗方法》現分爲以下四十四部分：

——第1部分：總則；

——第2部分：急性經口毒性試驗；

——第3部分：急性經皮毒性試驗；

——第4部分：急性吸入毒性試驗；

——第5部分：急性眼刺激性／腐蝕性試驗；

——第6部分：急性皮膚刺激性／腐蝕性試驗；

——第7部分：皮膚致敏試驗；

——第8部分：鼠傷寒沙門氏菌回覆突變試驗；

——第9部分：體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗；

——第10部分：體外哺乳動物細胞基因突變試驗；

——第11部分：體內哺乳動物骨髓嗜多染紅細胞微核試驗；

——第12部分：體內哺乳動物骨髓細胞染色體畸變試驗；

——第13部分：哺乳動物精原細胞／初級精母細胞染色體畸變試驗；

——第14部分：齧齒類動物顯性致死試驗；

——第15部分：亞急性經口毒性試驗；

——第16部分：亞急性經皮毒性試驗；

——第17部分：亞急性吸入毒性試驗；

——第18部分：亞慢性經口毒性試驗；

——第19部分：亞慢性經皮毒性試驗；

——第20部分：亞慢性吸入毒性試驗；

——第21部分：致畸試驗；

——第22部分：兩代繁殖毒性試驗；

——第23部分：遲發性神經毒性試驗；

——第24部分：慢性經口毒性試驗；

——第25部分：慢性經皮毒性試驗；

——第26部分：慢性吸入毒性試驗；

——第27部分：致癌試驗；

——第28部分：慢性毒性／致癌性聯合試驗；

——第29部分：毒物代謝動力學試驗；

——第30部分：皮膚變態反應試驗-局部淋巴結法；

——第31部分：大腸桿菌回覆突變試驗；

——第32部分：酵母菌基因突變試驗；

——第33部分：果蠅伴性隱性致死試驗；

——第34部分：枯草桿菌基因重組試驗；

——第35部分：體外哺乳動物細胞程序外DNA合成（UDS）試驗；

——第36部分：體內哺乳動物外周血細胞微核試驗；

——第37部分：體外哺乳動物細胞姊妹染色單體交換試驗；

——第38部分：體內哺乳動物骨髓細胞姊妹染色體交換試驗；

——第39部分：精子畸形試驗；

——第40部分：繁殖／生長發育毒性篩選試驗；

——第41部分：亞急性毒性合併繁殖／發育毒性篩選試驗；

——第42部分：一代繁殖試驗；

——第43部分：神經毒性篩選組合試驗；

——第44部分：免疫毒性試驗。

本部分爲GBZ/T 240的第8部分。

本部分的附錄A是資料性附錄。

本部分由衛生部職業衛生標準專業委員會提出。

本部分由中華人民共和國衛生部批准。

本部分起草單位：廣西職業病防治研究所、中國疾病預防控制中心職業衛生與中毒控制所。

本部分主要起草人：陳曉琴、許建寧、孫金秀、林錚。

化學品毒理學評價程序和試驗方法第8部分：鼠傷寒沙門氏菌回覆突變試驗

4 1 範圍

GBZ/T 240的本部分規定了鼠傷寒沙門氏菌回覆突變試驗（Ames試驗）的試驗目的、試驗概述、試驗方法、結果評價、評價報告和結果解釋。

本部分適用於檢測化學品（有殺菌作用的除外）的致突變性。

5 2 規範性引用文件

下列文件對於本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用於本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用於本文件。

GBZ/T 224 職業衛生名詞術語

GBZ/T 240.1 化學品毒理學評價程序和試驗方法 第1部分：總則

6 3 術語和定義

GBZ/T 240.1界定的術語和定義適用於本文件。

3.1

回覆突變 reverse mutation

細菌由營養缺陷型回變到野生型。

3.2

鼠傷寒沙門氏菌回覆突變試驗 salmonella typhimurium reverse mutation assay

利用一組鼠傷寒沙門氏組氨酸缺陷型試驗菌株，測定化學品引起沙門氏菌鹼基置換或移碼突變所誘發的組氨酸缺陷型（his^-）回變到野生型（his⁺）的試驗方法。

7 4 試驗目的

檢測化學品的誘變性，預測其遺傳危害和潛在致癌作用的可能性。

8 5 試驗概述

鼠傷寒沙門氏組氨酸營養缺陷型菌株不能合成組氨酸，故在缺乏組氨酸的培養基上，僅有少數自發回覆突變的細菌生長。假如有致突變物存在，則營養缺陷型的細菌回覆突變成野生型，因此能生長形成菌落，據此判斷受試樣品是否爲致突變物。

某些致突變物需要代謝活化後才能引起回覆突變，故需加入外源性代謝活化系統，如S₉。

9 6 試驗方法

9.1 6.1 受試樣品處理

選定受試樣品的合適溶劑，首選無菌水作爲溶劑。如果不溶於水的或水溶性低的化學品，可選二甲基亞碸。

9.2 6.2 劑量設計

決定受試樣品高劑量的標準是對細菌的毒性及其溶解度。自發回變數的減少，背景變得清晰或被處理的培養物細菌存活數減少，都是毒性的標誌。每一受試樣品檢測時至少設五個劑量組，劑量設定範圍爲5 μg/皿～5000μg/皿，也可根據預試驗結果按等比組距設定檢測的劑量範圍。

9.3 6.3 試驗方法

9.3.1 6.3.1 配製培養基和試劑

6.3.1.1 20%葡萄糖溶液

稱取200 g葡萄糖，加入蒸餾水至1000 mL，0.055 MPa高壓滅菌20 min。貯於4℃冰箱。

6.3.1.2 0.5 mmol/L組氨酸-0.5 mmol/L生物素溶液成分

D-生物素（相對分子質量 244）   122 mg

L-組氨酸（相對分子質量 155）   78 mg

無菌蒸餾水   至1000 mL

不宜進行高壓滅菌處理，使用無菌玻璃器皿配製。貯於4℃冰箱。

6.3.1.3 代謝活化系統

大鼠肝微粒體酶S，其誘導和製備方法見附錄A。

6.3.1.4 鹽溶液（1.65 mol/L KCl-0.4 mol/L MgCl₂）成分

氯化鉀（KCl）   61.5 g

氯化鎂（MgCl₂·6H₂O）   40.7 g

蒸餾水   至500 mL

0.103 MPa高壓滅菌30 min。貯於4℃冰箱。

6.3.1.5 0.2 mol/L磷酸鹽緩衝液（pH7.4）成分

磷酸二氫鈉（NaH₂PO₄·2H₂O）   2.965 g

磷酸氫二鈉（Na₂HPO₄·12H₂O）   29.015 g

蒸餾水   至500 mL

0.103 MPa高壓滅菌30 min。貯於4℃冰箱。

6.3.1.6 0.15 moI/L氯化鉀溶液

稱取氯化鉀11.18 g，用蒸餾水稀釋至1000 mL，0.103 MPa高壓滅菌30 min。貯於4℃冰箱。

6.3.1.7 氨苄青黴素鹼性溶液（8 mg/mL）

稱取氨苄青黴素80 mg，加入0.02 mol/L NaOH溶液10 mL。

6.3.1.8 0.1%結晶紫溶液

稱取結晶紫10 mg，加10 mL無菌水。

6.3.1.9 四環素溶液（8 mg/mL）

稱取四環素40 mg，加入0.02 mol/L HCl溶液5 mL。

6.3.1.10 溶解或稀釋化學物質常用溶劑：蒸餾水、二甲基亞碸（DMSO）。

6.3.1.11 常用陽性對照及參考劑量（參見GB 15193.4—2003）：

柔毛黴素（Pubescens）   6.0μg/皿

疊氮化鈉（NaN3）   1.5μg/皿

2-氨基芴（2-FA）   10μg／皿L

敵克松（dexon）   50μg/皿

絲裂黴素C（mytomycin C，MMC）   0.5μg/皿

6.3.1.12  Vogel-Bonner（V-B）培養基E成分

枸櫞酸（C₆H₈O₇·H₂O）   100 g

磷酸氫二鉀（K₂HPO₄）   500 g

磷酸氫氨鈉（NaNH₄HPO₄·4H₂O）   175 g

硫酸鎂（MgSO₄·7H₂O）   10 g

蒸餾水   至1000 mL

先將前三種成分加熱溶解後，再將溶解的硫酸鎂緩緩倒入容量瓶中，加蒸餾水稀釋至1000 mL，分裝後0.103 MPa高壓滅菌30 min。貯於4℃冰箱。

6.3.1.13 頂層培養基成分

瓊脂粉   1.2 g

氯化鈉   1.0 g

蒸餾水   至200 mL

0.103 MPa高壓滅菌20 min後，加入0.5 mmol/L組氨酸-0.5 mmol/L生物素溶液。

6.3.1.14 底層培養基成分

瓊脂粉   7.5 g

蒸餾水   480 mL

V-B培養基E   10 mL

20%葡萄糖溶液   10 mL

先將前兩種成分於0.103 MPa高壓滅菌20 min後，再加入後兩種成分，充分混勻倒底層平板。按每皿25 mL～30 mL倒平皿，冷凝固化後倒置於37℃培養箱中24 h，備用。

6.3.1.15 肉湯培養基成分

牛肉膏   2.5 g

胰腖   5.0 g

磷酸氫二鉀（K₂HP0₄）   1.0 g

蒸餾水   至500 mL

將上述成分混合後，於0.103 MPa高壓滅菌30 min。貯於4℃冰箱。

6.3.1.16 營養瓊脂平板成分

瓊脂粉   7.5 g

營養肉湯培養基   500 mL

0.103 MPa高壓滅菌20 min後，倒斜面或平板。

9.4 6.4 菌株

一般使用鼠傷寒沙門氏菌TA97a或TA97、TA98、TA100、TA102菌株，需要時可選用TA1535、TA1537等菌株。

9.4.1 6.4.1 分離

將新獲得的或經長期保存的試驗菌株分別劃線接種於主平板，37℃培養18 h～24 h。

9.4.2 6.4.2 增菌

用接種環分別刮取主平板中分離好的單個菌落分別接種於5 mL新鮮營養肉湯內增菌，37℃振盪（100次/min）培養10 h。該菌株培養物應每毫升不少於1×10⁹～2×10⁹活菌數。

9.4.3 6.4.3 保存

取增菌液0.8 mL，加高壓滅菌DMSO 0.07 mL置於2 mL已滅菌、耐低溫的帶塞小塑料試管內，冷凍後貯存於盛有液氮的液氮罐內冷藏備用，置4℃冰箱可保存一個月。

9.4.4 6.4.4 菌株鑑定

新獲得的或長期保存的菌種，在試驗前必須進行菌株的生物特性鑑定，菌株鑑定的判斷標準如表1所示。

表1 試驗菌株鑑定的判斷標準

6.4.4.1 組氨酸依賴性

組氨酸營養缺陷型菌株只能在有組氨酸的營養培養基中生長，在不加組氨酸的培養基上則不生長。

將組氨酸營養缺陷型菌株分別用劃線法接種於含有和不含有組氨酸的培養基中，37℃培養24 h，觀察細菌生長情況。組氨酸缺陷型菌株在含組氨酸平板上生長，而在無組氨酸平板上則不能生長或僅有少量增長。

6.4.4.2 脂多糖屏障丟失

具有深粗型突變（rfa）的菌株，其表面一層脂多糖屏障缺損，因此一些大分子物質如結晶紫能穿透菌膜進入菌體，從而抑制其生長，而野生型菌株則不受影響。

取0.1 mL營養牛肉湯增菌液加到2 mL 45℃～46℃已融化的頂層瓊脂中，搖勻，立即倒在有營養肉湯的底層瓊脂培養基上，使其均勻分佈。待瓊脂凝固後，在平皿中央放一直徑爲6 mm的圓濾紙，然後將結晶紫水溶液（1 mg/mL）10 μL滴在濾紙上。37℃培養24 h。假若待測菌在濾紙片周圍有清晰透明的抑菌圈，即表示結晶紫的分子已進入細菌體內，說明該待測菌株具有rfa突變。

6.4.4.3 紫外線損傷修復缺陷

具有紫外線損傷修復缺陷（△uvrB突變）的菌株對紫外線敏感，當受到紫外線照射後，不能生長，而具有野生型切除修復酶的菌株，則能照常生長。

在營養牛肉湯瓊脂培養基平皿的底部背面，用紅筆劃一直線，在培養基上沿紅線用劃線法接種細菌後，用黑紙覆蓋平皿的1/2，其餘部分用紫外線燈照射（15 W），距離33 cm，照射8s。紫外線照射部分不能生長，而黑紙覆蓋的那一半則能生長。具有△uvrB突變的菌株對紫外線敏感，經輻射後細菌不生長，而具有完整的切除修復系統的菌株，則照常生長。

6.4.4.4 抗氨苄青黴素R因子鑑定

含R因子的試驗菌株對氨苄青黴素有抗性。因爲R因子不太穩定，容易丟失，故用氨苄青黴素確定該質粒存在與否。

在營養牛肉湯瓊脂平皿背面中線，用紅筆劃一直線，再用微量注射器在培養基上沿紅線塗10μL氨苄青黴素，待其幹後與紅線垂直方向劃線接種細菌，37℃培養24 h。若待測菌在塗有氨苄青黴素的部位生長，說明該菌具有抗氨苄青黴素作用，表示含有R因子，仍能生長。否則表示待測菌不含R因子或R因子丟失。

6.4.4.5 抗四環素PAQ1質粒鑑定

含PAQ1質粒的試驗菌株對四環素有抗性。因爲PAQ1質粒不太穩定，容易丟失，故用四環素確定該質粒存在與否。

在營養牛肉湯瓊脂平皿背面中線，用紅筆劃一直線，再用微量注射器在培養基上沿紅線塗10μL四環素，待其幹後與紅線垂直方向劃線接種細菌，37℃培養24 h。若待測菌在塗有四環素的部位生長，說明該菌具有抗四環素作用，表示含有PAQ1質粒，仍能生長。否則表示待測菌不含PAQ1質粒或PAQ1質粒丟失。

6.4.4.6 自發回變

每一種試驗菌株都以一定的頻率自發地產生回變，稱爲自發回變。

將待測菌株增菌液0.1 mL加到2 mL含組氨酸一生物素的頂層瓊脂培養基的試管內，混勻後鋪到底層瓊脂平板上，待瓊脂固化後，置37℃培養箱中孵育48 h後記數每皿回變菌落數。每種標準測試菌株的自發回變菌落數應符合表2要求。經體外代謝活化後的自發回變菌落數，要比直接作用下的略高。

表2 測試菌株的回變性

6.4.4.7 陽性對照物的回變菌落數

9.5 6.5 試驗方法——平板摻入法

6.5.1 倒平板：先將底層培養基在45℃時倒平板，冷卻凝固後放入37℃培養箱內24 h。無菌落生長方可使用。

6.5.2 接種：將含0.5 mmol/L組氨酸-0.5 mmol/L生物素溶液的頂層瓊脂培養基2.0 mL分裝於試管中，45℃水浴中保溫，然後每管依次加入試驗菌株增菌液0.1 mL，受試樣品溶液0.1 mL和S₉混合液0.5 mL（需代謝活化時），充分混勻，迅速傾入底層瓊脂平板上，轉動平板，使之分佈均勻。水平放置待冷凝固化後，倒置於37℃培養箱裏孵育48 h。每受試樣品檢測皿加或不加S。混合液均作三個平行皿。

6.5.3 對照：每一受試樣品檢測時必須設定陽性物對照，即將操作過程中加入受試樣品溶液改換爲陽性物，其他操作完全相同；同時，每批受試樣品檢測必須設定陰性對照，觀察自發回變菌落數。操作過程中不加入受試樣品，其餘操作同本部分6.5.2。

6.5.4 試驗至少重複一次。

10 7 數據處理與結果評價

10.1 7.1 數據處理

記錄受試樣品各劑量組、空白對照組自發回變、溶劑對照組及陽性對照組的每皿回變菌落數，並求平均值和標準差。

10.2 7.2 結果評價

7.2.1 受試樣品誘發的回變菌落數超過自發回變菌落數2倍以上，並呈劑量一反應關係判定檢測結果爲陽性。

7.2.2 受試樣品經四個試驗菌株檢測後，只要有一個試驗菌株，無論在加S₉或不加S₉條件下爲陽性者時，均可判定該受試樣品Ames試驗結果爲陽性。

7.2.3 四個試驗菌株在加S₉和不加S₉條件下均爲陰性，且重複試驗結果一致時，則可判定受試樣品Ames試驗結果爲陰性。

11 8 評價報告

除GBZ/T 240.1規定的一般項目外，評價報告還應包括以下內容：

a） 試驗菌株；

b） 代謝活化系統及所用誘導劑；

c） 試驗方法、操作步驟、受試樣品檢測劑量分組及陰性、陽性對照名稱；

d） 陽性結果評價原則 以列表方式報告受試樣品的Ames試驗結果；

e） 結論。

12 9 結果解釋

陽性結果表明在本試驗條件下受試樣品具有致基因突變作用。陰性結果表明在本試驗條件下受試樣品不具有致基因突變作用。

13 附錄A（資料性附錄）大鼠肝微粒體酶的誘導和S9的製備

13.1 A.1 誘導

應用最廣泛的大鼠肝微粒體酶的誘導劑是多氯聯苯（Arodor1254）混合物，選擇健康雄性大鼠體重200 g左右，一次腹腔注射誘導劑500 mg/kg。誘導劑溶於玉米油中，濃度爲200 mg/mL。

13.2 A.2 S9製備

動物誘導後第5日斷頭處死。處死前12 h停止飲食，但可自由飲水。首先，用75%酒精消毒動物皮膚，剖開腹部。在無菌條件下，取出肝臟，去除肝臟的結締組織，用冰浴的0.15 mol/L氯化鉀淋洗肝臟，放入盛有0.15 mol/L氯化鉀溶液的燒杯裏。按每克肝臟加入0.10 mol/L氯化鉀溶液3 mL。用電動勻漿器製成肝勻漿，再在低溫（0℃～4℃）高速離心機上，以9000g離心10 min，取其上清液（S₉）組分分裝於塑料管中。儲存於液氮生物容器中或-80℃冰箱中備用。

上述全部操作均在冰水浴中和無菌條件下進行。製備肝S₉所用一切手術器械、器皿等，均經滅菌消毒。S₉置備後，其活力需經間接性誘變劑進行鑑定。