3 注射用重組人促紅素（CHO細胞）藥典標準
3.1 品名
3.1.1 中文名
3.1.2 漢語拼音
Zhusheyong Chongzu Ren Cuhongsu （CHO Xibao）
3.1.3 英文名
Recombinant Human Erythropoietin for Injection （CHO Cell）
3.2 定義、組成及用途
本品系由高效表達人紅細胞生成素（簡稱人促紅素）基因的中國倉鼠卵巢（CHO）細胞，經細胞培養、分離和高度純化後獲得的重組人促紅素凍乾製成。含適宜穩定劑，不含防腐劑和抗生素。
3.3 1 基本要求
生產和檢定用設施、原材料及輔料、水、器具、動物等應符合“凡例”的有關要求。
3.4 2 製造
3.4.1 2.1 工程細胞
3.4.1.1 2.1.1 名稱及來源
重組人促紅素工程細胞系由帶有人促紅素基因的重組質粒轉染的CHO-dhfr-（二氫葉酸還原酶基因缺陷型細胞）細胞系。
3.4.1.2 2.1.2 細胞庫建立、傳代及保存
由原始細胞庫的細胞傳代，擴增後凍存於液氮中，作爲主細胞庫；從主細胞庫的細胞傳代，擴增後凍存於液氮中，作爲工作細胞庫。各級細胞庫細胞傳代應不超過批准的代次。細胞凍存於液氮中，檢定合格後方可用於生產。
3.4.1.3 2.1.3 主細胞庫及工作細胞庫細胞的檢定
應符合“生物製品生產檢定用動物細胞基質製備及檢定規程”規定。
3.4.1.3.1 2.1.3.1 外源因子檢查
3.4.1.3.2 2.1.3.2 細胞鑑別試驗
應用同工酶分析、生物化學、免疫學、細胞學和遺傳標記物等任一方法進行鑑別，應爲典型CHO細胞。
3.4.1.3.3 2.1.3.3 人促紅素表達量
3.4.1.3.4 2.1.3.4 目的基因核苷酸序列檢查（工作種子批可免做）
3.4.2 2.2 原液
3.4.2.1 2.2.1 細胞的復甦與擴增
從工作細胞庫來源的細胞復甦後，於含滅能新生牛血清培養液中進行傳代、擴增，供轉瓶或細胞培養罐接種用。新生牛血清的質量應符合規定（2010年版藥典三部附錄XIII D）。
3.4.2.2 2.2.2 生產用細胞培養液
3.4.2.3 2.2.3 細胞培養
細胞培養全過程應嚴格按照無菌操作。細胞培養時間可根據細胞生長情況而定。
3.4.2.4 2.2.4 分離純化
收集的培養液採用經批准的超濾法或其他適宜方法進行濃縮，多步色譜純化後製得高純度的重組人促紅素，即爲人促紅素原液。除菌過濾後保存於適宜溫度，並規定其有效期。
3.4.2.5 2.2.5 原液檢定
按3.1項進行。
3.4.3 2.3 半成品
3.4.3.1 2.3.1 配製與除菌
3.4.3.2 2.3.2 半成品檢定
按3.2項進行。
3.4.4 2.4 成品
3.4.4.1 2.4.1 分批
3.4.4.2 2.4.2 分裝及凍幹
應符合“生物製品分裝和凍幹規程”及2010年版藥典三部附錄Ⅰ A有關規定。半成品應及時分裝、冷凍。凍乾的全過程中，製品溫度應不高於30℃。
3.4.4.3 2.4.3 規格
應爲經批准的規格。
3.4.4.4 2.4.4 包裝
應符合“生物製品包裝規程”及2010年版藥典三部附錄Ⅰ A有關規定。
3.5 3 檢定
3.5.1 3.1 原液檢定
3.5.1.1 3.1.1 蛋白質含量
用4g/L碳酸氫銨溶液將供試品稀釋至0.5～2mg/ml，作爲供試品溶液。以4g/L碳酸氫銨溶液作爲空白，測定供試品溶液在320nm、325nm、330nm、335nm、340nm、345nm和350nm的吸光度。用讀出的吸光度的對數與其對應波長的對數作直線迴歸，求得迴歸方程。照紫外一可見分光光度法（2010年版藥典三部附錄Ⅱ A），在波長276～280nm處，測定供試品溶液最大吸光度Amax，將Amax對應波長代入迴歸方程求得供試品溶液由於光散射產生的吸光度A光散射。按下式計算供試品蛋白質含量，應不低於0.5mg/ml。
3.5.1.2 3.1.2 生物學活性
3.5.1.2.1 3.1.2.1 體內法
依法測定（2010年版藥典三部附錄Ⅹ B）。
3.5.1.2.2 3.1.2.2 體外法
按酶聯免疫法試劑盒介紹測定。
3.5.1.3 3.1.3 體內比活性
每Img蛋白質應不低於1.0×105IU。
3.5.1.4 3.1.4 純度
3.5.1.4.1 3.1.4.1 電泳法
依法測定（2010年版藥典三部附錄Ⅳ C）。用非還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，考馬斯亮藍染色，分離膠膠濃度爲12.5%，加樣量應不低於10μg，經掃描儀掃描，純度應不低於98.0%。
3.5.1.4.2 3.1.4.2 高效液相色譜法
依法測定（2010年版藥典三部附錄Ⅲ B）。親水硅膠體積排阻色譜柱，排阻極限300kD，孔徑24nm，粒度10μm，直徑7.5mm，長30cm;流動相爲3.2mmol/L磷酸氫二鈉－1.5mmol/L磷酸二氫鉀－400.4mmol/L氯化鈉，pH7.3；上樣量應爲20～100μg，在波長280nm處檢測，以人促紅素色譜峯計算的理論板數應不低於1500。按面積歸一化法計算人促紅素純度，應不低於98.0%。
3.5.1.5 3.1.5 分子量
依法測定（2010年版藥典三部附錄Ⅳ C）。用還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，考馬斯亮藍R250染色，分離膠膠濃度爲12.5%，加樣量應不低於1μg，分子質量應爲36～45kD。
3.5.1.6 3.1.6 紫外光譜
依法測定（2010年版藥典三部附錄Ⅱ A），用水或生理氯化鈉溶液將供試品稀釋至0.5～2mg/ml，在光路1cm、波長230～360nm下進行掃描，最大吸收峯應爲279nm±2nm;最小吸收峯應爲250nm±2nm;在320～360nm處應無吸收峯。
3.5.1.7 3.1.7 等電聚焦
取尿素9g、30%丙烯酰胺單體溶液6.0ml、40% pH3～5的兩性電解質溶液1.05ml、40% pH 3～10的兩性電解質溶液0.45ml、水13.5ml，充分混勻後，加入N,N,N',N'-四甲基乙二胺15μl和10%過硫酸銨溶液0.3ml，脫氣後製成凝膠，加供試品溶液20μl（濃度應在每1ml含0.5mg以上），照等電聚焦電泳法（2010年版藥典三部附錄Ⅳ D）進行，同時做對照。電泳圖譜應與對照品一致。
3.5.1.8 3.1.8 唾液酸含量
每1mol人促紅素應不低於10.0mol（2010年版藥典三部附錄Ⅵ C）。
3.5.1.9 3.1.9 外源性DNA殘留量
每10000IU人促紅素應不高於100pg（2010年版藥典三部附錄Ⅸ B）。
3.5.1.10 3.1.10 CHO細胞蛋白質殘留量
採用雙抗體夾心酶聯免疫法檢測，應不高於蛋白質總量的0.05%。
3.5.1.11 3.1.11 細菌內毒素檢查
每10000IU人促紅素應小於2EU（2010年版藥典三部附錄Ⅻ E凝膠限度試驗）。
3.5.1.12 3.1.12 牛血清白蛋白殘留量
依法測定（2010年版藥典三部附錄Ⅷ I），應不離於蛋白質總量的0.01%。
3.5.1.13 3.1.13 肽圖
供試品經透析、凍幹後，用1%碳酸氫銨溶液溶解並稀釋至1.5mg/ml，依法測定（2010年版藥典三部附錄Ⅷ E），其中加入胰蛋白酶（序列分析純），37℃±0.5℃保溫6小時，色譜柱爲反相C8柱（25cmX4.6mm，粒度5μm，孔徑30nm），柱溫爲45℃±0.5℃；流速爲每分鐘0.75ml；進樣量爲20μl;按下表進行梯度洗脫（表中A爲0.1%三氟乙酸水溶液，B爲0.1%三氟乙酸－80%乙腈水溶液）。
編號 | 時間/分鐘 | 流速/ml | A/% | B/% |
1 | 0.00 | 0.75 | 100.0 | 0.0 |
2 | 30.00 | 0.75 | 85.0 | 15.0 |
3 | 75.00 | 0.75 | 65.0 | 35.0 |
4 | 115.00 | 0.75 | 15.0 | 85.0 |
5 | 120.00 | 0.75 | 0.0 | 100.0 |
6 | 125.00 | 0.75 | 100.0 | 0.0 |
7 | 145.00 | 0.75 | 100.0 | 0.0 |
肽圖應與人促紅素對照品一致。
3.5.1.14 3.1.14 N端氨基酸序列（至少每年測定1次）
Ala-Pro-Pro-Arg-Leu-Ile-Cys-Asp-Ser-Arg-Val-Leu-Glu-Arg-Tyr。
3.5.2 3.2 半成品檢定
3.5.2.1 3.2.1 細菌內毒素檢查
每1000IU人促紅素應小於2EU（2010年版藥典三部附錄Ⅻ E凝膠限度試驗）。
3.5.2.2 3.2.2 無菌檢查
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅻ A），應符合規定。
3.5.3 3.3 成品檢定
除復溶時間、水分測定和裝量差異檢查外，應按標示量加入滅菌注射用水，復溶後進行其餘各項檢定。
3.5.3.1 3.3.1 鑑別試驗
按免疫印跡法（2010年版藥典三部附錄Ⅷ A）或免疫斑點法（2010年版藥典三部附錄Ⅷ B）測定，應爲陽性。
3.5.3.2 3.3.2 物理檢查
3.5.3.2.1 3.3.2.1 外觀
應爲白色疏鬆體，復溶後應爲無色澄明液體。
3.5.3.2.2 3.3.2.2 復溶時間
加入標示量的滅菌注射用水，復溶時間應不超過2分鐘。
3.5.3.2.3 3.3.2.3 可見異物
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅴ B），應符合規定。
3.5.3.2.4 3.3.2.4 裝量差異
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅰ A），應符合規定。
3.5.3.3 3.3.3 化學檢定
3.5.3.3.1 3.3.3.1 水分
應不高於3.0%（2010年版藥典三部附錄Ⅶ D）。
3.5.3.3.2 3.3.3.2 pH值
依法測定（2010年版藥典三部附錄Ⅴ A），應符合批准的要求。
3.5.3.3.3 3.3.3.3 鈉離子含量
應不大於190mmol/L（2010年版藥典三部附錄Ⅶ J）。
3.5.3.3.4 3.3.3.4 人血白蛋白含量
若製品中加入人血白蛋白作穩定劑，則應符合批准的要求（2010年版藥典三部附錄Ⅵ B第二法）。
3.5.3.3.5 3.3.3.5 滲透壓摩爾濃度
依法測定（2010年版藥典三部附錄Ⅴ H），應符合批准的要求。
3.5.3.4 3.3.4 生物學活性
3.5.3.4.1 3.3.4.1 體外法
按酶聯免疫法試劑盒介紹測定，應爲標示量的80%～120%。
3.5.3.4.2 3.3.4.2 體內法
依法測定（2010年版藥典三部附錄Ⅹ B），應爲標示量的80%～140%。
3.5.3.5 3.3.5 無菌檢查
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅻ A），應符合規定。
3.5.3.6 3.3.6 細菌內毒素檢查
每1000IU人促紅素應小於2FU; 5000IU/支以上規格的人促紅素，每支應小於10EU（2010年版藥典三部附錄Ⅻ E凝膠限度試驗）。
3.5.3.7 3.3.7 異常毒性檢查
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅻ F小鼠試驗法），應符合規定。
3.6 4 保存、運輸及有效期
於2～8℃避光保存和運輸。自生產之日起，按批准的有效期執行。
3.7 5 使用說明
3.8 版本
《中華人民共和國藥典》2010年版