2 英文參考
Purified Protein Derivative of Tuberculin(TB-PPD)[2010年版藥典]
3 結核菌素純蛋白衍生物藥典標準
3.1 品名
3.1.1 中文名
3.1.2 漢語拼音
Jiehejunsu Chundanbai Yanshengwu
3.1.3 英文名
Purified Protein Derivative of Tuberculin（TB-PPD）
3.2 定義、組成及用途
本品系用結核分枝桿菌經培養、殺菌、過濾除去菌體後純化製成的純蛋白衍生物，用於結核病的臨牀診斷、卡介苗接種對象的選擇及卡介苗接種後機體免疫反應的監測。
3.3 1 基本要求
生產和檢定用設施、原材料及輔料、水、器具、動物等應符合“凡例”的有關要求。
結核菌素純蛋白衍生物（TB-PPD）生產車間必須符合國家生物安全防護等級的要求，必須與其他生物製品生產車間及實驗室分開，原液生產全部過程，包括結核分枝桿菌的滅活，應在完全隔離的區域內進行，所需設備及器具均須單獨設置並專用。直接用於生產的金屬或玻璃等器具，應經過嚴格清洗及滅菌處理。從事TB-PPD生產的工作人員必須身體健康，經X射線檢查無結核病，且每年經X射線檢查1～2次，可疑者應暫離該製品的製造。
3.4 2 製造
3.4.1 2.1 菌種生產用菌種
3.4.1.1 2.1.1 名稱及來源
採用人型結核分枝桿菌CMCC 93009（H37Rv）菌株。
3.4.1.2 2.1.2 種子批的建立
3.4.1.3 2.1.3 種子批的傳代
3.4.1.4 2.1.4 種子批的檢定
3.4.1.4.1 2.1.4.1 染色鏡檢
3.4.1.4.2 2.1.4.2 生化反應
硝酸鹽還原反應、尿素酶反應應爲陽性，耐熱觸酶、聚山梨酯80水解應爲陰性（2010年版藥典三部附錄XIV）。
3.4.1.5 2.1.5 種子批的保存
3.4.2 2.2 原液
3.4.2.1 2.2.1 生產用種子
取工作種子批菌種於蘇通馬鈴薯培養基或改良蘇通綜合培養基或其他適宜培養基中傳代培養，作爲生產用種子。
3.4.2.2 2.2.2 培養基
採用蘇通馬鈴薯培養基、改良蘇通綜合培養基或經批准的其他培養基。
3.4.2.3 2.2.3 接種和培養
啓開菌種後接種於蘇通馬鈴薯培養基，置37℃培養2～3周，可在蘇通馬鈴薯培養基上再傳1代或直接挑取生長良好的菌膜，移種子改良蘇通綜合培養基或其他適宜培養基的表面，於37℃靜置培養1～2周，挑取發育良好的菌膜移種子改良蘇通綜合培養基或其他培養基的表面，於37℃靜置培養8～10周。凡在培養期間或培養終止時，有菌膜下沉、發育異常或污染雜菌者，應廢棄。
3.4.2.4 2.2.4 收穫及殺菌
培養終止，將培養物於121℃、30分鐘殺菌後，過濾除去菌膜及菌體。如濾液需保存，應加入3.0g/L苯酚或其他適宜的防腐劑，於2～8℃保存，保存期不超過30天。
3.4.2.5 2.2.5 純化
收集濾液進行純化。用三氯乙酸和飽和硫酸銨法分別沉澱蛋白質，或採用經批准的方法純化，除菌過濾後即爲原液。
3.4.2.6 2.2.6 合併與分裝及凍幹
3.4.2.6.1 2.2.6.1 合併
同批分次純化的原液可以合併，但不得超過5次。
3.4.2.6.2 2.2.6.2 分裝及凍幹
原液檢定合格後，可根據蛋白質含量將原液稀釋至規定濃度，定量分裝，分裝後立即凍幹。
3.4.2.7 2.2.7 原液檢定
按3.1項進行。
3.4.2.8 2.2.8 保存及有效期
原液應於2～8℃保存。液體原液自效價測定合格之日起，有效期爲5年；原液凍幹品自效價測定合格之日起，每隔5年應按3.1項進行檢定，合格後可繼續使用。
3.4.3 2.3 半成品
3.4.3.1 2.3.1 配製
經檢定合格的原液，用0.01mol/L PBS （pH7.2～7.4含0.0005%聚山梨酯80及3.0g/L苯酚）稀釋至20IU/ml或50IU/ml。
3.4.3.2 2.3.2 半成品檢定
按3.2項進行。
3.4.4 2.4 成品
3.4.4.1 2.4.1 分批
3.4.4.2 2.4.2 分裝
3.4.4.3 2.4.3 規格
每瓶1ml、2ml。每1次人用劑量爲0.1ml，含TB-PPD 5IU、2IU。
3.4.4.4 2.4.4 包裝
3.5 3 檢定
3.5.1 3.1 原液檢定
3.5.1.1 3.1.1 外觀
原液凍幹品應爲白色疏鬆體。液體原液及凍幹品復溶後應呈棕黃色澄明液體，無不溶物或雜質。
3.5.1.2 3.1.2 復溶時間
3.5.1.3 3.1.3 水分
凍幹品水分應不高於3.0%，（2010年版藥典三部附錄Ⅶ D）。
3.5.1.4 3.1.4 純度
3.5.1.4.1 3.1.4.1 蛋白質含量
依法測定（2010年版藥典三部附錄Ⅵ B第二法）。
3.5.1.4.2 3.1.4.2 多糖與核酸含量（2）核酸含量測定 量取本品2～3ml，採用紫外－可見分光光度法（2010年版藥典三部附錄Ⅱ A），在波長260nm處測定吸光度，按=200計算核酸含量。
3.5.1.5 3.1.5 效價測定
3.5.1.5.1 3.1.5.1 動物法
將標準品及本品分別稀釋3個不同稀釋度，至少取4只已經結核分枝桿菌致敏的體重爲400～600g的白色雌性豚鼠，去毛後於背部脊柱兩側相對部位，分別皮內注射上述稀釋度本品各0.1ml或0.2ml，於注射後24小時、48小時觀察局部硬結的縱徑與橫徑（可根據48、小時的反應結果判定）。計算每個稀釋度注射後2天的硬結反應總和或平均面積，並求其比值，每個稀釋度本品與相應濃度標準品的比值應爲0.8～1.2。如不符合上述要求，可調整稀釋度後再測定效價，直至符合要求。
3.5.1.5.2 3.1.5.2 稀釋度選擇
稀釋度的選擇應能使本品注射後24小時所產生的局部硬結反應直徑爲8～25mm;本品和標準品的硬結反應直徑大小應相似，且本品和標準品的3個稀釋度的劑量對數反應曲線應基本平行。如本品效價與標準品效價不一致，可用同樣方法複試1次，並算出相當於標準品的效價，進行調整，調整後再重新抽樣測定效價，直至符合要求。
3.5.1.6 3.1.6 無菌檢查
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅻ A）應符合規定。
3.5.1.7 3.1.7 無分枝桿菌試驗
量取1.0ml本品，分別接種於10支羅氏雞蛋培養基，於37℃培養4周，應無分枝桿菌生長。
3.5.1.8 3.1.8 致敏效應試驗
試驗組與對照組分別選用體重300～400g未做過任何試驗的豚鼠各3只，試驗組每隻豚鼠皮內注射0.1ml含500IU本品，共3次，每次間隔5天。在第3次注射後15天，試驗組與對照組每隻豚鼠各皮內注射0.1ml含500IU本品，連續觀察3天，兩組動物反應無明顯區別。
3.5.2 3.2半成品檢定
3.5.2.1 無菌檢查
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅻ A）應符合規定。
3.5.3 3.3 成品檢定
3.5.3.1 3.3.1 鑑別試驗
取經結核分枝桿菌致敏的豚鼠至少4只，皮內注射0.2ml本品，24小時後豚鼠的平均硬結反應直徑（縱、橫直徑相加除以2）均應不小於5mm。
3.5.3.2 3.3.2 物理檢查
3.5.3.2.1 3.3.2.1 外觀
應爲無色澄明液體，無不溶物或異物。
3.5.3.2.2 3.3.2.2 裝量
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅰ A），應不低於標示量。
3.5.3.3 3.3.3 化學檢定
3.5.3.3.1 3.3.3.1 pH值
應爲6.8～7.4（2010年版藥典三部附錄Ⅴ A）。
3.5.3.3.2 3.3.3.2 苯酚含量
應不高於3.0g/L（2010年版藥典三部附錄Ⅵ M）。
3.5.3.4 3.3.4 效價測定
取經致敏的體重爲400～600g豚鼠，皮內注射0.2ml標準品與本品，至少各4只，注射後24小時、48小時各觀察結果1次（可根據48小時的反應結果判定），計算本品和TB-PPD標準品的平均硬結反應直徑，計算累計值，並求其比值，應爲0.8～1.2。
3.5.3.5 3.3.5 無菌檢查
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅻ A），應符合規定。
3.5.3.6 3.3.6 異常毒性檢查
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅻ F），應符合規定。
3.6 4 保存、運輸及有效期
3.7 5 使用說明
3.8 版本
《中華人民共和國藥典》2010年版