2 註解
三雜交系統(three-binding hybrid system)用於分析蛋白和RNA間的相互作用。Senguptaxi等首先報道了應用三雜技系統分析金屬調節蛋白(iron regulatory protein-1，IRP1)與金屬反應元件(iron response element，IRE)RNA序列，以及HIV轉錄激活蛋白(trans-activator protein， Tat)與HIV轉錄激活反應元件(HIV trans-activation response element，TAR)RNA序列間的作用。
三雜交系統的基本原理是將一個已知的RNA結合蛋白與轉錄因子的DNA結合domain(如LexA)構建第一個融合蛋白，第二種蛋白(待選的RNA結合蛋白)與轉錄激活結構域構建融合蛋白。此外構建和表達一雜合RNA，含有二個不同的結合位點。當RNA與二個RNA結合蛋白的結合位點相互作用時可激活報道基因的轉錄和表達。如Dhruba等在IRP1與IRE的RNA相互作用的研究中，第一個RNA結合蛋白選用噬菌體MS2被殼蛋白(MS2 coat protein)，MS2 coat protein可識別RNA中的21nt的莖環序列，並與之有較高的親和力。將其與LexA融合構建雜合蛋白。IRP1與Gal4的激活結構域(activation domain)融合構建另一個雜合蛋白。IRE mRNA在非編碼區有21nt的莖環區序列，編碼區編碼與IRP1特異性結合的蛋白序列。在實驗中他們用一質粒表達雜交RNA，含2個MS2 coat protein結合位點和1個IRE。
三雜交系統提供了快速、多用的體內檢測RNA-蛋白間相互作用的新方法。與雙雜交系統相比，雜交RNA與雜交蛋白有些不同：首先，雜交RNA分子可能不是生理結構，雜交的不同RNA組分對正常結構會有一定影響。但Dhruba的研究表明，局部、相對穩定的結構區如MS2 coat protein，IRP1識別位點等可在體內共存於同一雜交RNA分子中。其次，這些RNA中的莖環區結構相當穩定，RNA只要形成部分正確結構，則足以介導轉錄激活作用。
象雙雜交系統一樣，三雜交系統具有廣泛的應用。〈1〉應用此系統可分析確定RNA--蛋白作用的精確結構域，甚至單個核苷酸或氨基酸殘基。〈2〉用於鑑定和克隆識別結合有重要生理功能RNA(如轉錄、定位、RNA病毒包裝和感染等)的蛋白質，可用於調控的機理研究、疾病的防治以及抗病毒藥物的研製開發。〈3〉通過構建雜交RNA庫，可篩選與特定蛋白結合的RNA。〈4〉有可能在此基礎上發展四雜交系統研究RNA-RNA間的相互作用。