2 註解
密度梯度是用以防止對流保持pH梯度，避免已分離物質再混合的重要措施則由重溶液和輕溶液以梯度混合形成。用做密度梯度的溶質應具有以下條件：溶解度高，粘度低；密度大，得到的密度差不低於0.12克/釐米3，不與樣品蛋白質起反應，不解離。最常用的是蔗糖（分析純），它對蛋白質不僅無害還有保護作用。重溶液含蔗糖50%（W/V)，這時柱上和柱下最大密度差爲0.2克/釐米3，濃度太高則粘度過大適用。蔗糖在高pH值時會分解，影響pH梯度及pI值測定，這種情況下可改用甘油，也可用甘露醇，山梨醇，右旋糖酐等。
在測定未知蛋白時，可先採用pH3-10的載體，經初步測定後改用較窄的以提高分辨率，在使用pH7以上或以下範圍時，因缺少中性載體，在聚焦過程中載體與電極之間在pH7部位就會形成純水區帶，純水的電導極低，必須避免此現象。凡使用離開中性的pH範圍的載體時應加入相當於0.1載體量的pH6-8或pH3-10的載體。在用pH低於3的範圍時，可加有機酸如一氯醋酸，二氯醋酸，甲酸，乙酸，pH離於10時，可補加胺使pH增加到11。載體在pH6附近電導較低，可以與蔗糖密度梯度互相補償，蔗糖濃度高時電導低，所以可把pH6電導低部位放在柱上部，也就是用pH6以下範圍時，陰極在上，而用pH6以上範圍時，陽極在上方。
電聚焦有高的分辨力，一般樣品不需提純，分析上可用來測定混合物中某一成分的相對比例：如大量提純蛋白質，則應預先初步提純。有些物質（如核酸）聚焦時會沉澱，應預先除去。蛋白質應不含鹽，因鹽濃度高電流大，易發熱，而且鹽離子遷移至兩極產生酸鹼，佔據了分離的有效部位。加樣體積不受限制，最高可達80-85毫升。 等電點聚焦的分離容量受下列幾個因素影響：聚焦後每一區帶的蛋白量取決於密度梯度所能支持的蛋白質，提高密度可以提高分離容量；容量與區帶高度的平方成正比，降低電壓可使區帶變寬，提高容量，但分辨率降低，聚焦時間長，用窄的pH梯長範圍可以使區帶變寬，提高分辨率。用110毫升柱時，每一區帶蛋白質含量最高可達２0-25毫克，由於粗蛋白樣品可分爲很多區帶，所以總量可以加至幾百毫克；分離的容量與柱的橫載面成正比，用440毫克柱時，可加粗蛋白質5克，每一區帶可達一克。