WS/T 594—2018 蠅類抗藥性檢測方法 家蠅不敏感乙酰膽鹼酯酶等位基因檢測法

1 拼音

WS/T 594—2018 yíng lèi kàng yào xìng jiǎn cè fāng fǎ jiā yíng bù mǐn gǎn yǐ xiān dǎn jiǎn zhǐ méi děng wèi jī yīn jiǎn cè fǎ

2 英文參考

Test methods of fly resistance to insecticides-A molecular method for detecting insensitive ace allele in the Musca domestica

3 基本信息

ICS 11.020

C 05

中華人民共和國衛生行業標準WS/T 594—2018《蠅類抗藥性檢測方法 家蠅不敏感乙酰膽鹼酯酶等位基因檢測法》（Test methods of fly resistance to insecticides-A molecular method for detecting insensitive ace allele in the Musca domestica）由中國人民共和國國家衛生和計劃生育委員會2018年3月1日《關於發佈推薦性衛生行業標準〈蠅類抗藥性檢測方法 家蠅不敏感乙酰膽鹼酯酶等位基因檢測法〉的通告》（國衛通〔2018〕3號）發佈。該標準自2018年8月1日起施行。

4 發佈通知

關於發佈推薦性衛生行業標準《蠅類抗藥性檢測方法 家蠅不敏感乙酰膽鹼酯酶等位基因檢測法》的通告

國衛通〔2018〕3號

現發佈推薦性衛生行業標準《蠅類抗藥性檢測方法 家蠅不敏感乙酰膽鹼酯酶等位基因檢測法》，編號和名稱如下：

WS/T 594—2018 蠅類抗藥性檢測方法 家蠅不敏感乙酰膽鹼酯酶等位基因檢測法

該標準自2018年8月1日起施行。

特此通告。

國家衛生計生委

2018年3月1日

5 前言

本標準按照GB/T 1.1—2009給出的規則起草。

本標準主要起草單位：中國科學院動物研究所、北京市疾病預防控制中心、揚州大學、中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所、中國農業大學、中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院微生物流行病研究所、上海市疾病預防控制中心。

本標準主要起草人：邱星輝、李梅、曾曉芃、錢坤、周小潔、李靜、劉起勇、高希武、趙彤言、冷培恩。

6 標準正文

蠅類抗藥性檢測方法 家蠅不敏感乙酰膽鹼酯酶等位基因檢測法

6.1 1 範圍

本標準規定了家蠅不敏感乙酰膽鹼酯酶等位基因的檢測方法。

本標準適用於家蠅乙酰膽鹼酯酶第342氨基酸位點基因型的檢測。

6.2 2 術語和定義

下列術語和定義適用於本文件。

6.2.1 2.1 乙酰膽鹼酯酶 acetyl cholinesterase

存在於生物體的一種水解酶，由乙酰膽鹼酯酶基因ace編碼。

6.2.2 2.2 等位基因 allele

存在於同一物種的相同基因的不同形式互稱爲等位基因。

6.2.3 2.3 342G、342V 和 342A

342G、342V和342A分別表示家蠅乙酰膽鹼酯酶第342氨基酸殘基位點上的氨基酸爲甘氨酸（Gly）、纈氨酸（Val）和丙氨酸（Ala）。

6.3 3 樣本採集

採用誘捕或網捕等方法從現場採集家蠅成蟲內，浸泡在100%乙醇溶液中帶回實驗室。浸泡樣品可在4 ℃條件下短期（6個月內）保存，可在-20 ℃以下長期保存。

6.4 4 引物

引物F的序列爲CGGTGCATTTGGGTTTCTAC，引物R的序列爲 CGTAACCGCTAAGATCTGCTG。引物設計參照附錄A。配製爲10 μmol/L濃度，保存於-20 ℃冰櫃。

6.5 5 儀器設備

5.1 PCR（聚合酶鏈式反應）儀。

5.2 瓊脂糖凝膠電泳儀。

5.3 凝膠成像儀。

5.4 恆溫水浴鍋。

6.6 6 主要試劑

6.1 DNA聚合酶（Taq酶）。

6.2 限制性內切酶Bsp1286I。

6.3 限制性內切酶Eae I。

6.7 7 操作步驟

7.1 在 PCR 管中加入 10×PCR 緩衝液 (含 100 mmol/L Tris-HCl, 500 mmol/L KCl, 15 mmol/L MgCl₂) 2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2.0 μL，引物 F 0.5 μL，引物 R 0.5 μL，單頭家蠅的基因組 DNA 1 μL（100 ng～300 ng，提取方法可參見附錄 B，也可用商售的 DNA 提取試劑盒或其他類似方法提取）和 Taq酶 (2～5 個單位)，用滅菌水補齊至 25 μL，混勻。

7.2 將 PCR 管放入 PCR 儀中，設置 PCR 反應程序爲：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃30 s，35 個循環；72 ℃ 10 min。運行程序。

7.3 PCR 運行結束後，取 5 μL PCR 產物在 1.5% 的瓊脂糖凝膠上進行電泳，電壓設定在 160 V，電泳20 min 後在紫外光下檢測，有清楚單一的 609bp 的條帶的 PCR 產物用於進行以下酶切反應。

7.4 取合格樣品（即電泳檢測產物爲 609bp）的 PCR 產物設置兩個酶切反應，反應 A 用 Bsp1286I 酶、反應 B 用 Eae I 酶進行酶切，酶切反應體系的設置根據酶產品的使用說明進行（參見附錄 C）。

7.5 將酶切後的產物上樣在 1.5% 的瓊脂糖凝膠上，電壓設定在 160 V，電泳 20 min 後在紫外光下檢測。

6.8 8 基因型確定

根據酶切產物的電泳結果（參見附錄 D），確定家蠅個體的乙酰膽鹼酯酶的基因型，見表 1。

表1 家蠅個體乙酰膽鹼酯酶的基因型確定

7 附錄A（資料性附錄）引物設計參照序列

342V CGGTGCATTTGGGTTTCTACATCTTTCACCGGTTATGCCAGGTTTTGAAGAAGAAGCTCC

342A CGGTGCATTTGGGTTTCTACATCTTTCACCGGTTATGCCAGGTTTTGAAGAAGAAGCTCC

342G CGGTGCATTTGGGTTTCTACATCTTTCACCGGTTATGCCAGGTTTTGAAGAAGAAGCTCC

342V CGGCAACGTGGGTCTTTGGGATCAGGCCTTGGCCTTGCGTTGGCTGAAGGAGAATGCCCG

342A CGGCAACGTGGGCCTCTGGGATCAGGCCTTGGCCTTGCGTTGGCTTAAGGAGAATGCCCG

342G CGGCAACGTGGGCCTTTGGGATCAGGCCTTGGCCTTGCGTTGGCTGAAGGAGAATGCCCG

342V TGCATTTGGCGGCAATCCGGAATGGATGACGCTGTTTGGTGAATCGGCTGGTTCGAGTTC

342A TGCATTTGGCGGCAATCCGGAATGGATGACGCTGTTTGGTGAATCGGCTGGTTCGAGTTC

342G TGCATTTGGCGGCGATCCCGAATGGATGACGCTGTTTGGTGAATCGGCTGGTTCGAGTTC

342V CGTGAATGCTCAACTGATGTCGCCGGTAACGCGTGGCCTGGTCAAACGTGGTATGATGCA

342A CGTGAATGCTCAACTGATGTCGCCGGTAACGCGTGGCCTGGTCAAACGTGGCATGATGCA

342G CGTGAATGCTCAACTGATGTCGCCGGTAACGCGTGGCCTTGTCAAACGTGGCATGATGCA

342V GTCGGTCACAATGAATGCTCCCTGGAGCCACATGACATCAGAGAAGGCGGTTGAAATTGG

342A GTCGGCCACAATGAATGCTCCCTGGAGCCACATGACATCAGAGAAGGCGGTTGAAATTGG

342G GTCGGGCACAATGAATGCTCCCTGGAGCCACATGACATCAGAGAAGGCGGTTGAAATTGG

342V TAAAGCTTTGGTAAATGACTGTAACTGTAATGCCTCATTGTTACCGGTAAGCAGTGGAGT

342A TAAAGCTTTGGTAAATGACTGTAACTGTAATGCCTCATTGTTACCGGTAAGCAGTGGAGT

342G TAAAGCTTTGGTAAATGACTGTAACTGTAATGCCTCATTGTTACCGGTAAGCAGTGGAGT

342V ATTTATGCGACTATACGAATTTTTCTTTGCTGATGAATTTTATTTTCCTCTTTTTTGTGT

342A ATTTATGCGACTATACGAATTTTTCTTTGCTGATGAATTTTATTTTCCTCTTTTTTGTGT

342G ATTTATGCGATTACACGAATTATTCTTTGCTGATGAATTTTATTTTCGGCTTCTTTGTGT

342V TTTCAACTTAGGAAAATCCACAAGCTGTCATGGCTTGCATGCGACAGGTTGATGCGAAAA

342A TTTCAACTTAGGAAAATCCACAAGCTGTCATGGCTTGCATGCGACAGGTTGATGCGAAAA

342G TTTCAACTTAGGAAAATCCCCAAGCTGTCATGGCTTGCATGCGACAGGTTGATGCGAAAA

342V CAATTTCTGTCCAACAATGGAACTCGTATTCTGGAATTTTAAGTTATCCCTCGGCCCCAA

342A CAATTTCTGTCCAACAATGGAACTCGTATTCTGGAATTTTAAGTTATCCCTCGGCCCCAA

342G CAATTTCTGTCCAACAATGGAACTCGTATTCTGGAATTTTAAGTTTTCCCTCGGCCCCAA

342V CTATAGATGGAGCATTTTTGCCCGCAGATCCAATGACACTGTTGAAAACAGCAGATCTTA

342A CTATAGATGGAGCATTTTTGCCCGCAGATCCAATGACACTGTTGAAAACAGCAGATCTTA

342G CTATAGATGGTGCATTTTTGCCCGCAGATCCAATGACACTGTTGAAAACAGCAGATCTTA

342V GCGGTTACG

342A GCGGTTACG

342G GCGGTTACG

注：下劃線分別對應上游引物與下游引物序列(反向互補)； 方框內爲編碼342位氨基酸的密碼子。

8 附錄B（資料性附錄）家蠅基因組 DNA 提取方法

B.1 取單頭家蠅，去除腹部後置於 1.5mL體積的離心管 (eppendorf 管) 中，加入 0.5 mL 新鮮配製的裂解液（含 100 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，10 mmol/L EDTA，50 mmol/L NaCl, 1% SDS，0.15 mmol/L 精胺，0.5 mmol/L 亞精胺 和 2 U/mL的蛋白酶K），碾磨將蟲體搗碎，置 60 ℃溫浴，20 min後取出。

B.2 加入 75 μL的 8 M醋酸鉀，混勻，置冰上 10 min。

B.3 14000 g 離心 5 min，取 400 μL上清液轉至新的離心管。

B.4 加入 800 μL 冰冷的 100%乙醇，室溫放置 10 min

B.5 離心 10 min，棄上清，離心沉澱用 500 μL的 70%乙醇清洗。

B.6 離心 5 min，沉澱乾燥後（可置超淨臺中，開通風），加入 50 μL滅菌水或TE緩衝液（10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH=8.0）中溶解。提取的DNA樣品可直接用於PCR。樣品保存 4 ℃備用，也可於 -20 ℃中長期保存。

9 附錄C（資料性附錄）酶切體系設置範例

C.1 酶切反應體系的設置見表C.1。

表C.1 酶切反應體系

C.2 37℃下進行溫浴，時間 2h～4h，反應結束，直接用於電泳檢測。

10 附錄D（資料性附錄）家蠅乙酰膽鹼酯酶 342 位點不同基因型 PCR 產物的酶切結果

家蠅乙酰膽鹼酯酶342位點不同基因型的PCR產物酶切結果見圖D.1。

G——氨基酸殘基爲Gly（甘氨酸）；

V——氨基酸殘基爲Val（纈氨酸）；

A——氨基酸殘基爲Aal（丙氨酸）；

G/G——敏感型純合子；

V/V——不敏感 I型純合子；

A/A——不敏感II型純合子；

G/V——不敏感I型/敏感型雜合子；

G/A——不敏感II型/敏感型雜合子；

V/A——不敏感I型/不敏感II型雜合子；

1——Bsp1286I酶切產物圖；

2——EaeI酶切產物圖。

注：最右側道爲DNA分子量標記。

圖D.1 家蠅乙酰膽鹼酯酶342位點不同基因型PCR產物的酶切結果

11 標準下載

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