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定點突變技術——從單點突變到多點突變
體外定點突變技術是研究蛋白質結構和功能之間的複雜關係的有力工具,也是我們在實驗室中改造/優化基因常用的手段。蛋白質的結構決定其功能,二者之間的關係是蛋白質組研究的重點之一。對某個已知基因的特定鹼基進行...
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新非典可追源——發現兩個定點突變是病毒從蝙蝠傳播到人的關鍵
...MERS和從蝙蝠中分離出來的類似病毒進行比較,發現兩個定點突變可以使蝙蝠中的類似病毒有效感染人體細胞。 自2012年9月在沙特首次被發現至今,被稱爲“新非典”的MERS在中東的感染人數已超過1100人,致死率在40%左右。...
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中美科學家合作發現MERS病毒關鍵突變
...徵病毒和蝙蝠中分離出來的類似病毒進行比較,發現兩個定點突變就可以使蝙蝠中的類似病毒有效感染人體細胞。自2012年9月在沙特首次被發現起至今,被稱爲“新非典的MERS在中東的感染人數已超過1100人,致死率在40%左右...
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冠狀病毒從蝙蝠傳播到人——科學家發現中東呼吸綜合徵關鍵突變
...徵病毒和蝙蝠中分離出來的類似病毒進行比較,發現兩個定點突變就可以使蝙蝠中的類似病毒有效感染人體細胞。 自2012年9月在沙特首次被發現以來,中東呼吸綜合徵在中東的感染人數已超過1100人,致死率40%左右。今年5月...
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生化與細胞所研究探索在細胞內酵母tRNALeu的功能
...,也與tRNA有關。目前,通常採用T7RNA聚合酶轉錄和核苷酸定點突變的體外方法研究tRNA的功能。體外轉錄得到的tRNA無修飾鹼基,可能影響tRNA的活性。定點突變得到tRNA變種工作量大、耗時。在體外研究tRNA與aaRS的相互作用的研究受...
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遺傳發育所利用CRISPR-Cas系統對植物進行定點基因組編輯
...短柄草、水稻等植物物種中建立了TALEN核酸酶介導的基因定點突變技術體系(Shanetal.,2013,MolecularPlant)。最近,該實驗室利用CRISPR-Cas系統定點突變了水稻和小麥兩個作物的OsPDS和TaMLO等5個基因。原生質體中基因突變效率爲14.5-38%,...
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進化信息照亮了果蠅Toll通路配體蛋白功能表面
...最終導致抗真菌肽Drosomycin的表達。利用進化信息指導的定點突變策略,動物天然免疫研究組科研人員成功解析了Spatzle蛋白的功能表面。這一工作目前已被國際雜誌CellMolLifeSci接受發表。該項研究首先運用生物信息學方法發現和...
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上海生科院揭示CRISPR/Cas系統在水稻中產生突變的機制
...成功實現了對模式植物擬南芥和農作物水稻中特定基因的定點突變(Miaoetal.,2013,MolecularPlant;Fengetal.,2013,CellResearch),並進一步在擬南芥中研究了CRISPR/Cas誘導的基因突變或基因校正的模式、效率、特異性及遺傳度等(Fengetal.,2014...
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GluRS的人工進化
...家們一直對這兩種酶的進化關係十分感興趣,嘗試着通過定點突變的方法互換它們之間的識別特異性,但結果並不令人滿意。大腸桿菌GlnRS活性中心的22個氨基酸曾經被定點突變,也只獲得了十分微弱的GluRS活性,大約是真正GluRS...
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木質纖維素降解酶的分子改造研究取得新進展
...用計算機預測軟件PoPMuSiC對其進行理性設計和預測,通過定點突變的方法把黑麴黴阿魏酸酯酶FaeA在50°C熱失活半衰期從8分鐘提高到77分鐘,催化轉化數提高10倍,單位體積培養液中的酶活力提高30倍以上;利用家族改組、定點突變...
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武漢病毒所揭示乙型腦炎病毒入侵機制
...個關鍵氨基酸位點或區段對病毒入侵可能至關重要,利用定點突變技術將16個突變引入E基因,並通過反向遺傳操作系統構建一系列E蛋白單點突變或區段缺失的重組病毒。他們意外地發現,10個突變不能有效地產生子代病毒顆粒,...
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人白細胞介素-3突變體的構建及在大腸桿菌中表達的研究
...:第三軍醫大學分子生物學教研室,重慶630038關鍵詞:PCR定點突變;hIL-3;cDNA突變體;高水平表達;hIL-3突變體 中國圖書分類號 R392.11 摘 要 目的:爲了在大腸桿菌中高效表達hIL-3cDNA,獲得hIL-3蛋白,擬對天然型hIL-3...
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專訪張博:兩篇Nature子刊技術論文開創同源重組新方法
...上首次利用TALEN在斑馬魚中成功實現可穩定遺傳的基因組定點突變;2013年又在此基礎上,發表NatureMethods文章,利用TALEN造成的DNA雙鏈斷裂,大大提高了同源重組效率,從而在模式生物斑馬魚中實現了真正意義上的同源重組基因打...
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iPS有缺陷嗎?中國博後如是說
...達80%成功率的基因打靶方法,從而建立了PNH疾病基因PIG-A定點突變的幹細胞克隆。這一重要的研究成果公佈在《CellStemCell》雜誌上。文章的通訊作者是細胞工程研究所的程臨釗教授,早年畢業於中科大,之後獲得約翰霍普金斯醫...
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肖庚富小組:對乙腦病毒說不
...位點或區段對病毒入侵可能至關重要。“我們想利用定點突變技術將這16個突變引入E基因。並通過反向遺傳操作系統構建16個E蛋白單點突變或區段缺失的重組病毒。這是劉海濱和同事們一開始的設想。然而在實驗操作過程中...
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人可溶性IL-6R及其突變體基因在COS7細胞中的表達及活性分析①
...enceVersion2.0DNASequenceKit,並按其說明書進行。 1.2.3 DNA定點突變 按Promega公司“DNA體外突變系統”說明書進行並略加改動。 1.2.4 脂質體介導DNA轉染COS7細胞 按Gibco公司的LIPOFECTIN使用說明書進行。 1.2.5 sIL-6R的ELISA檢...
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副粘病毒融合蛋白分子上特異性細胞融合作用位點的初步確定
...異性區域,弄清F融合細胞的分子機理。方法 採用基因定點突變法,創造一個酶切位點,得到突變株,然後用基因重組的方法得到各種重組株,並於真核細胞內進行表達,Gimsa染色和指示基因法檢測細胞融合功能,熒光強度分析...
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斑駁病一家系c—kit基因突變檢測及共聚焦激光掃描顯微鏡皮損觀察
...DNA,PCR擴增c—kit基因編碼區21對外顯子,DNA直接測序,確定點突變的位點。結果患者白斑處共聚焦激光掃描成像結果顯示基底層幾乎無黑素細胞分佈,白斑與色素斑交雜區掃描顯示基底層及真皮乳頭周圍黑素細胞呈竈性或區域性...
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朱健康小組成功打造植物基因組“剪刀”
...。張波濤等通過對模式植物擬南芥和水稻的多個基因進行定點突變,都獲得了較高的突變效率,並在第一代獲得純合和嵌合突變體,且呈現出預期的突變表型。該研究首次證實CRISPR-Cas系統能夠用於植物的基因組編輯。這一研究...
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腸毒素性大腸桿菌CS3菌毛呈現載體的構建
...測分析,確定外源表位的插入位點,重疊延伸PCR方法進行定點突變,將口蹄疫病毒VP1插入到CS3中以驗證表面呈現能力;用重組菌腹腔注射免疫小鼠以探討其抗原性。結果 在大腸桿菌CS3的136位氨基酸殘基後突變插入BamHⅠ酶切點...
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肥厚型心肌病心肌肌鈣蛋白ⅠR145W突變對大鼠心肌細胞鈣調控的影響
...基因突變(cTnⅠR145W)引起HCM發病的可能機制。方法採用定點突變技術在大鼠cTnⅠcDNA引入R146W(相當於人R145W)突變,增強型綠色熒光蛋白(EGFP)做報告基因,構建含野生型和突變型大鼠cTnⅠcDNA的重組腺病毒載體。Langendoff逆流...
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兩個點突變普遍引起昆蟲非特異性羧酸酯酶性質的改變
...喬傳令研究員和康樂研究員團隊開展合作研究,利用體外定點突變技術,對七種昆蟲包括重要農作物害蟲棉蚜、褐飛蝨、赤擬谷盜、斜紋夜蛾,異色瓢蟲、家蠶、蜜蜂的非特異性羧酸酯酶基因進行位點特異性突變,通過構建融合...
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中科院成都生物所木聚糖酶研究成果獲國家專利
...對的半理性設計方法確定部分潛在熱穩定相關位點,通過定點突變方法得到熱穩定相關突變體。經上述突變文庫構建、篩選以及半理性設計方法,獲得5個熱穩定性顯著提高的突變體,其熱失活半衰期比野生型提高2-52倍,顯示出...
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NEJM:抑制關鍵基因的表達可精準控制脂肪濃度
...碼apoC-III蛋白的apoC3基因,血脂含量顯著降低。通過這種定點突變方法,拯救了一名患有罕見的嚴重高甘油三酯血癥的患者。通過這一個別案例,研究人員意外的找到解析控制血脂機理的關鍵:通過抑制某關鍵基因——apoC3——的...
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成都生物所一種1,4-β-D-木聚糖酶突變體獲國家發明專利
...對的半理性設計方法確定部分潛在熱穩定相關位點,通過定點突變方法得到熱穩定相關突變體。經上述突變文庫構建、篩選以及半理性設計方法,獲得5個熱穩定性顯著提高的突變體,其熱失活半衰期比野生型提高2-52倍,顯示出...
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乙型肝炎病毒C型重組桿狀病毒的構建及鑑定
...桿狀病毒vAcHBVc。採用連續聚合酶鏈反應(PCR)引入方法進行定點突變,構建YVDD變異株質粒,並按照上述方法構建HBVYVDD變異株重組桿狀病毒vAcHBVYVDD,擴增並滴定。爲便於觀察重組桿狀病毒的轉染和擴增效率及病毒滴度測定,同時構...
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耐輻射球菌基因修復機制新認識
...r0615的突變體對H2O2表現超敏感,但對電離輻射不甚敏感。定點突變和體內功能分析表明,DrOxyR蛋白的C210對感受H2O2是必須的,定量PCR和轉錄丰度分析表明,DrOxyR既是轉錄激活子也是轉錄抑制子,能調節Mn/Fe的平衡。本研究表明,Ox...
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天津工生所等解析出糖苷水解酶第120家族首個晶體結構
...礎,以利於進一步闡明XylC的催化機理;同時可以爲通過定點突變等方式改善酶的活性提供依據;對了解XylC底物特異性及耐熱性的分子機理奠定了基礎。研究成果已經被BiochemicalJournal(448:401-407)接收,該項目獲得工業酶國家工...
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天津工業生物所等在己二酸生物合成關鍵酶設計優化和應用方面取得新進展
...分子建模確認G72、L73和P76是影響酶活的關鍵氨基酸殘基,定點突變發現L73F、P76A以及L73F/P76A可以有效提高突變體的酶活,最高達10倍左右。進一步的動力學表徵也顯示突變可以增加酶的反應速度。發酵實驗表明,突變體相比出發...
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人源一磷酸腺苷激活蛋白激酶催化亞基自抑制機制研究
...是很清楚。通過對人源AMPKα1催化亞基採用截短、缺失、定點突變及結構模擬等分子生物學方法發現:一段不同種屬間保守的含有α螺旋的殘基片段313-335對於α1催化亞基的自抑制活性起到很重要的作用,其中該自抑制片段內的Leu32...