重組B亞單位／菌體霍亂疫苗（腸溶膠囊）藥典標準
品名
中文名
重組B亞單位／菌體霍亂疫苗（腸溶膠囊）
漢語拼音
Chongzu B Yadanwei/Junti Huoluan Yimiao（Changrongjiaonang）
英文名
Recombinant B-subunit/Whole Cell Cholera Vaccine（Enteric-coated Capsule）
定義、組成及用途
本品系將霍亂毒素B亞單位基因重組質粒（pMM-CTB）轉化大腸桿菌MM2，使其高效表達霍亂毒素B亞單位（CTB），經純化、凍乾製成千粉；O1羣霍亂弧菌經培養、滅活、凍乾製成菌粉。將兩者混合後加入適宜輔料製成腸溶膠囊，用於預防霍亂和產毒性大腸桿菌旅行者腹瀉。
1 基本要求
生產和檢定用設施、原材料及輔料、水、器具、動物等應符合“凡例”及國家生物安全防護的有關規定。
2 製造
2.1 原液
2.1.1 混合前原液
2.1.1.1 霍亂菌體原液
應符合本品種附錄1“霍亂菌體原液製造及檢定要求”中1項的規定。
2.1.1.2 重組霍亂毒素B亞單位原液
應符合本品種附錄2“重組霍亂毒素B亞單位原液製造及檢定要求”中1項的規定。
2.1.2 原液檢定
2.1.2.1 霍亂菌體原液
應符合本品種附錄1“霍亂菌體原液製造及檢定要求”中2項的規定。
2.1.2.2 重組霍亂毒素B亞單位原液
應符合本品種附錄2“重組霍亂毒素B亞單位原液製造及檢定要求”中2項的規定。
2.1.3 原液凍幹
2.1.3.1 霍亂菌體凍乾粉
將霍亂菌體原液用稀釋液稀釋後，冷凍乾燥製成菌粉。
2.1.3.2 重組霍亂毒素B亞單位凍乾粉
將重組霍亂毒素B亞單位原液用稀釋液稀釋後，冷凍乾燥製成凍乾粉。
2.2 半成品
2.2.1 配製將霍亂菌體凍乾粉、重組霍亂毒素B亞單位凍乾粉與適
宜輔料按一定比例混勻製成藥粉，使每粒（240mg）含霍亂菌體5.0×1010個，重組霍亂毒素B亞單位1mg，用於製備膠囊。
2.2.2 半成品檢定按3.1項進行。
2.3 成品
2.3.1 分批
應符合“生物製品分批規程”的規定。
2.3.2 分裝
應符合“生物製品分裝和凍幹規程”及附錄Ⅰ F有關規定。
2.3.3 規格
每粒膠囊裝量240mg，含霍亂菌體5.0×1010個，重組霍亂毒素B亞單位1mg。
2.3.4 包裝
應符合“生物製品包裝規程”及附錄IF有關規定。
3 檢定
3.1 半成品檢定微生物限度
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅻ G），每1g半成品細菌數不得超過1000個，黴菌和酵母菌數不得超過100個，不得檢出大腸埃希菌。
3.2 成品檢定
3.2.1 鑑別試驗
3.2.1.1 染色鏡檢
應爲革蘭氏陰性弧形桿菌。
3.2.1.2 免疫雙擴散法
採用免疫雙擴散法（2010年版藥典三部附錄Ⅷ C），供試品應與兔抗CTB血清產生與對照品一致的沉澱線。
3.2.2 物理檢查
3.2.2.1 外觀膠囊內藥粉爲淡黃色或淺褐色均勻粉末。
3.2.2.2 裝量差異
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅰ F），應符合規定。
3.2.3 崩解時限
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅴ C），應符合規定。
3.2.4 乾燥失重
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅶ L），膠囊內容物在80℃幹烤至恆重，減失重量應不得超過5.0%。
3.2.5 重組霍亂毒素B亞單位（CTB）含量測定
採用免疫單擴散法測定，CTB含量應爲標示量的100%～200%。
用0.9%氯化鈉溶液將霍亂毒素B亞單位（CTB）標準品稀釋至適宜稀釋度，將膠囊內容物用0.9%氯化鈉溶液稀釋至每1ml含CTB約30μ9的供試品溶液，分別加入含適量CTB抗血清的凝膠板中，置溼盒中於37℃孵育擴散適宜時間，染色至沉澱圈顯色清晰，用脫色液脫去背景顏色後，測量各沉澱圈的直徑，以標準品濃度對數值爲縱座標，對應沉澱圈直徑的平均值爲橫座標作直線迴歸，求得直線迴歸方程。將供試品沉澱圈直徑代入迴歸方程，計算供試品的濃度。
3.2.6 微生物限度按3.1項進行。
3.2.7 免疫力試驗
採用間接酶聯免疫法檢測免疫組小鼠血清抗體水平，與對照組小鼠血清相比較，免疫組小鼠霍亂弧菌抗體滴度應不低於對照組4倍，免疫組小鼠CTB抗體滴度應不低於對照組8倍。
取膠囊內容物，用磷酸鹽緩衝液（pH 7.4）稀釋至每1ml含菌1.0×109個，免疫體重10～12g小鼠至少10只，每隻腹腔注射2次，每次0.5ml（含菌5.0×108個），間隔7天；對照組注射液爲磷酸鹽緩衝液（pH 7.4）。末次免疫後3～7天眼窩取血，分離血清並將免疫組各只小鼠血清和對照組各只小鼠血清分別等量混合。用含10%小牛血清和0.1% Tween-20的磷酸鹽緩衝液（pH 7.4）將上述血清分別稀釋400倍待用。將上述免疫血清稀釋至適宜稀釋度，以未免疫組小鼠血清爲對照，採用間接酶聯免疫法分別測定免疫血清中霍亂弧菌抗體和CTB抗體。計算對照組小鼠血清OD值的均值（X）+3SD，選取免疫組小鼠血清系列稀釋度中OD值大於對照組X+3SD的最大稀釋倍數，以此最大稀釋倍數除以對照組血清稀釋倍數得到免疫組小鼠抗體滴度倍數。
4 保存、運輸及有效期
於2～8℃乾燥保存和運輸。自生產之日起，有效期24個月。
5 附錄
附錄1 霍亂菌體原液製造及檢定要求
附錄2 重組霍亂毒素B亞單位原液製造及檢定要求
6 使用說明
應符合“生物製品包裝規程”規定和批准的內容。
附錄1 霍亂菌體原液製造及檢定要求
本品系用O1羣古典生物型或Eltor生物型霍亂弧菌經培養、加入甲醛溶液殺菌後凍乾製成，用於製備重組B亞單位／菌體霍亂疫苗（腸溶膠囊）。
1 製造
1.1 菌種
生產用菌種應符合“生物製品生產檢定用菌毒種管理規程”的有關規定。
1.1.1 名稱及來源
採用霍亂弧菌O1羣古典生物型16012菌株或Eltor生物型18001菌株。來源於中國醫學細菌保藏管理中心。
1.1.2 種子批的建立
應符合“生物製品生產檢定用菌毒種管理規程”的有關規定。
1.1.3 種子批的傳代
主種子批菌種啓開後傳代次數不得超過5代；工作種子批菌種啓開後至接種生產用培養基傳代次數不得超過5代。
1.1.4 種子批的檢定
主種子批應進行以下全面檢定，工作種子批應進行1.1.4.1～1.1.4.3（1）項檢定。
1.1.4.1 培養特性及染色鏡檢
將待檢菌種接種於pH 7.8～8.2的肉湯瓊脂或其他適宜培養基，置37℃培養18～24小時，應爲光滑，半透明的圓形菌落。塗片染色鏡檢應爲革蘭氏陰性短小弧桿菌。
1.1.4.2 生化反應
發酵甘露糖和蔗糖，產酸不產氣，不發酵阿拉伯糖。
1.1.4.3 血清學試驗
（1）用特異性血清作玻片凝集反應時，應與本型血清相凝集。
（2）用霍亂弧菌O多價診斷血清（原效價不低於1: 640）與18～24小時的O1霍亂弧菌培養物以生理氯化鈉溶液稀釋成細菌懸液（每1ml含菌1.8×109左右）進行定量凝集試驗，凝集效價應不低於原血清效價之半。
1.1.4.4 毒力試驗
將37℃培養8～16小時的培養物刮入30.0g/L鹼性蛋白腖水中，比濁後用胃膜素或其他適宜稀釋液稀釋成不同濃度的菌懸液。每個濃度的菌懸液用體重18～20g小鼠5只，每隻腹腔注射0.5ml，觀察3天。計算LD50應不超過2×108個菌。
1.1.4.5 抗原性試驗
選體重約2.0kg的家兔3只，靜脈注射3次，每次0.5ml，第1次注射含菌1.0×109，第二次注射含菌2.0×109，第三次注射含菌3.0×109，每次間隔7天，末次注射後10～14天採血做定量凝集試驗，2/3家兔血清之凝集效價達到1: 2000（+）即爲合格。
1.1.5 種子批的保存
原始種子批和主代種子批應凍幹保存於室溫。工作種子批爲半固體穿刺管室溫保存，保存時間24個月。
1.2 原液
製造霍亂疫苗應用O1羣古典生物型或Eltor生物型霍亂弧菌（根據流行情況確定）。
1.2.1 生產用種子
啓開工作種子批菌種，接種LB培養基，製備生產用工作種子。
1.2.2 生產用培養基
採用改良M9培養基。生產用培養基不得含有使人產生毒性反應或變態反應的物質。
1.2.3 培養收穫
1.2.3.1 培養以液體培養法培養的種子液，用無菌操作注入培養罐內，37℃培養，種子罐4～8小時，發酵罐6～10小時。
1.2.3.2 純菌檢查
培養物塗片進行革蘭氏染色鏡檢，應爲革蘭氏陰性短小弧桿菌，若鏡檢發現有雜菌生長，應廢棄。
1.2.3.3 殺菌
加入終濃度不超過1% （ml/ml）的甲醛溶液，於37℃殺菌2～3天。
1.2.3.4 殺菌檢查
純菌試驗合格的菌液，應取樣接種不含瓊脂的硫乙醇酸鹽培養基，瓊脂斜面及鹼性瓊脂斜面各1管，於37℃培養5天，若有菌生長應廢棄。
1.2.3.5 收穫
用0.45μm膜進行切向流超濾濃縮獲取菌體，超濾後用滅菌生理氯化鈉溶液連續洗滌，並製成菌懸液分裝於容器中。
2 檢定
2.1 染色鏡檢
應爲典型革蘭氏陰性短小弧桿菌。
2.2 凝集試驗
與霍亂弧菌O多價診斷血清作玻片定性凝集試驗，呈陽性反應。
2.3 無菌檢查
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅻ A），應符合規定。另加試1%鹼性蛋白腖水培養基1管，於30～35℃培養，應無菌生長。
2.4 濃度測定
按“中國細菌濁度標準”測定，每1ml含菌應爲5.0×1011～1.05×1012。
2.5 遊離甲醛殘留量
每5.0×1010菌中含遊離甲醛不得過0.16mg（2010年版藥典三部附錄Ⅶ）。
2.6 霍亂毒素殘留量
採用間接ELISA法檢測霍亂毒素（CT）殘留量，每5.0×1010菌中含霍亂毒素不得過10ng。
以神經節苷脂（GMl）包被，用適宜稀釋液將霍亂毒素對照品和供試品稀釋至適宜濃度測定。以對照品溶液吸光度對其相應的濃度進行4-參數方程擬合，將供試品OD值代入4-參數方程擬合得到供試品中CT含量。
3 保存及有效期
於2～8℃保存，自收菌之日起保存時間不超過6個月。
附錄2 重組霍亂毒素B亞單位原液製造及檢定要求
本品系將霍亂毒素B亞單位基因重組質粒（pMM-CTB）轉化大腸桿菌MM2，使其高效表達霍亂毒素B亞單位（CTB），純化後用於配製重組B亞單位／菌體霍亂疫苗（腸溶膠囊）。
1 製造
1.1 工程菌菌種
1.1.1 名稱及來源
重組霍亂毒素B亞單位工程菌株系由霍亂毒素B亞單位的重組質粒（pMM-CTB）轉化的大腸桿菌E.Coli MM2菌株。
1.1.2 種子批的建立
應符合“生物製品生產檢定用菌毒種管理規程”的規定。
1.1.3 種子批的傳代
主種子批菌種啓開後傳代次數不得超過5代；工作種子批菌種啓開後至接種生產用培養基傳代次數不得超過5代。
1.1.4 菌種檢定
主種子批和工作種子批的菌種應進行以下各項全面檢定。
1.1.4.1 培養特性
應呈典型大腸桿菌集落形態，無其他雜菌生長。
1.1.4.2 染色鏡檢
應爲典型的革蘭氏陰性桿菌。
1.1.4.3 對抗生素的抗性
在含氨苄青黴素爲50μg/ml的培養基上正常生長。
1.1.4.4 電鏡檢查（工作種子批可免做）
應爲典型的大腸桿菌形態，無支原體、病毒樣顆粒及其他微生物污染。
1.1.4.5 生化反應
應符合大腸桿菌生物學性狀。
1.4.4.6 重組霍亂毒素B亞單位表達量
用LB培養基或生產用培養基在搖牀中培養後，獲得的培養物上清液採用間接ELISA法檢測，以神經節苷脂（GMl）包被，以兔抗CTB血清爲一抗，辣根過氧化酶標記的羊抗兔抗體爲二抗。檢測結果應爲強陽性，P/N值應大於10。
1.1.4.7 質粒檢查
工程菌用快速方法或其他適宜方法提取DNA，以瓊脂糖凝膠電泳分析應檢出一個大小爲5.1kb的質粒。該質粒用Xba Ⅰ和EcoR Ⅰ雙酶切後在瓊脂糖凝膠電泳分析時應分別檢出2.4kb和2.7kb的DNA帶。電泳圖譜應與原始重組質粒相符。
1.1.4.8 目的基因核苷酸序列檢查（工作種子批可免做）
目的基因核苷酸序列應與批准的序列相符。
1.2 原液
1.2.1 生產用種子
1.2.1.1 將檢定合格的工作種子批菌種接種於含氨苄青黴素（100μg/ml） LB斜面培養基，於32℃培養過夜，供種子罐接種用。
1.2.1.2 在滅菌LB培養基中接種種子液，種子罐35℃培養3～8小時，供發酵罐接種用。
1.2.2 生產用培養基
採用不含任何抗生素的改良的M9培養基。
1.2.3 接種和培養
1.2.3.1 在滅菌發酵培養基中接種種子液。
1.2.3.2 35℃通氣攪拌發酵培養，異丙基-β-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導後培養8～12小時。
1.2.4 收穫
調節發酵液至適宜pH，連續離心，流速不高於每分鐘1000ml，收集上清液。
1.2.5 純化
將上清液稀釋至適宜電導率後，進行陽離子交換層析純化，採用含磷酸鹽緩衝液洗脫目標蛋白，在280nm波長下檢測層析峯，收集目標峯，得到CTB純化液。
1.2.6 濃縮
採用適宜截留分子量的超濾膜，濃縮CTB溶液濃度到0.7mg/ml以上。
1.2.7 除菌過濾
將CTB濃縮液進行除菌過濾，分裝於適宜容器中，即爲CTB原液，於2～8℃保存。
2 原液檢定
2.1 CTB濃度測定
用0.9%氯化鈉溶液將原液稀釋至每1ml含CTB約30μg，按正文3.2.5項進行，CTB濃度應不低於0.7mg/ml。
2.2 電泳純度
依法測定（2010年版藥典三部附錄Ⅳ C），用還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，分離膠膠濃度爲15%，加樣量應不低於2.5μg（考馬斯亮藍R250染色法）。經掃描儀掃描，純度應不低於95.0%。
2.3 分子量
依法測定（2010年版藥典三部附錄Ⅳ C），用還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，分離膠膠濃度爲15%，加樣量應不低於0.5μg，分子量應爲11.6kD±1.2kD。
2.4 抗生素殘留量
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅸ A），不應有殘餘氨苄青黴素活性。
2.5 等電點
依法測定（2010年版藥典三部附錄Ⅳ D），主區帶等電點應爲7.2～8.2，且供試品的等電點圖譜應與對照品一致。
2.6 紫外光譜
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅱ A），在光路1cm、波長230～360nm下進行掃描，最大吸收峯波長應爲279nm±3nm。
2.7 肽圖
供試品的肽圖譜應與相應對照品的肽圖譜一致。
取供試品適量，用乙酸乙酸鈉緩衝液（pH 3.8）製成每1ml含4mg的溶液，於25℃放置72小時。取此液50μl，加Tris溶液（pH 10.9）150μl，Tris-乙酸緩衝液（pH 8.5）100μl，胰蛋白酶溶液[TPCK處理，用1mol/L乙酸－乙酸鈉緩衝液（pH 5.0）製成每1ml含1mg的溶液]40μl，混勻。置37℃水浴24小時後，加40μl冰乙酸終止反應，於10000轉／分鐘離心3分鐘，依法測定（2010年版藥典三部附錄Ⅷ E），其中色譜柱爲十八烷基硅烷鍵合硅膠柱，柱溫爲45℃，流速爲每分鐘0.5ml，按下表進行梯度洗脫（表中A爲0.1%三氟乙酸的水溶液，B爲0.1%三氟乙酸的乙腈溶液）。
時間（分鐘） |
流動相A%（V/V） |
流動相B%（V/V） |
0 |
100 |
0 |
10 |
95 |
5 |
30 |
75 |
25 |
45 |
65 |
35 |
60 |
55 |
45 |
2.8 無菌檢查
依法檢查（2010年版藥典三部附錄Ⅻ A），應符合規定。
2.9 N端氨基酸序列（至少每年測定一次）
用氨基酸序列分析儀測定，N端序列應爲：Thr-Pro-Gln-Asn-Ile-Thr-Asp-Leu-Cys-Ala-Glu-Tyr-His-Asn-Thr
3 保存及有效期
於2～8℃保存，原液自採集之日起保存時間不超過6個月。
版本
《中華人民共和國藥典》2010年版 第二增補本