SARS冠狀病毒 2009年02月24日修訂版

冠狀病毒是一羣具有套膜的RNA病毒，在電子顯微鏡下呈皇冠狀，其正性單股RNA約由27000~30000多個鹼基組成，爲已知最大的RNA病毒，可感染人、雞、豬、牛、鼠、貓等動物，會引發呼吸道與腸道的疾病，並引起人類輕微感冒。冠狀病毒分爲三大類，其中兩類感染哺乳動物，另一類只感染鳥類，基本上這類病毒的宿主相當專一，主要引發呼吸道與腸道感染。2003年新發現的一種冠狀病毒，爲引起人類嚴重急性呼吸道症候羣（SARS）。

嚴重急性呼吸綜合徵冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus：SARS CoV，SCoV  SARS冠狀病毒）屬與環狀病毒（torovirus）屬同爲動脈炎病毒科（arteriviridae），劃作套病毒（nidovims）目。冠狀病毒依其抗原性差異分爲3羣。SARSCoV與任何一羣的同源性均顯不高，有的研究者將其歸屬於2羣。Ksiazek示它可能爲兩羣的重組病毒。2005年6月Colorado會議提議將SCoV分類爲2羣。

冠狀病毒進化樹分析

SARS冠狀病毒在種屬分類上屬於“ssRNA positive-strand viruses”家系的“Nidovirales”族中的“Coronaviridae”系(見Taxonomy)。它是冠狀病毒家族中新出現的一個子類。全長29,736bp，已知有11個編碼序列（cds），而其中的一個cds（putative orf1ab polyprotein）與鼠類的肝炎病毒（murine hepatitis virus）結構類似，依據鼠類的肝炎病毒的結構模式，推斷出該段cds應該編碼了14個蛋白質。

SARS冠狀病毒概述

[參考資料] . "Department of Microbiology, University of Leicester". [參考資料] Ehud Lavi, Susan R. Weiss, Susan T. "The Nidoviruses (Coronaviruses and Arteriviruses)". Hingley, ADVANCES IN EXPERIMENTAL MEDICINE AND BIOLOGY, 494 October 2001 Hardbound 742 pp. ISBN 0-306-46634-1SARS冠狀病毒(SARS-Cov)，屬於巢狀病毒目(Order: Nidovirales),冠病毒科(Family:Coronaviridae)，冠狀病毒屬(Genus: Coronavirus)。根據其基因組結構分類，它屬於單鏈正義 RNA 病毒[(+)sense, ssRNA Virus]。

成熟的冠狀病毒顆粒直徑約爲 60 至 220nm 不等。其形態學上最顯著的特徵在於，在病毒包膜(envelope)外，有明顯的棒狀膜外子粒('club-shaped' peplomers)。這一酷似中世紀歐洲帝王王冠(crown)的結構（如圖 1），正是其”名字” - Coronavirus 的來源。

圖 1.  冠狀病毒電鏡照片（Department of Microbiology, University of Leicester） [參考資料] . "Department of Microbiology, University of Leicester".

對其他已知冠狀病毒的研究發現，其病毒包膜主要包括三種糖蛋白，分別命名爲S 蛋白(Spike Protein)、M 蛋白(Membrane Protein)、E 蛋白(Envelope Protein)。在部分病毒株中還能找到一種 HE 蛋白(Haemagglutinin-esterase)。其中 S 蛋白即伸出包膜的棒-球形的糖蛋白，它在病毒與宿主細胞表面受體結合及介導膜融合進入細胞的過程中，起關鍵性作用，也是冠狀病毒主要的抗原蛋白。M 蛋白則是一種跨膜蛋白，在病毒的包膜形成與出芽(budding)過程中起重要作用。E 蛋白是一種相對較小的蛋白質，主要散在分佈於病毒包膜上。冠狀病毒主要結構模式見圖 [參考資料] Holmes KV. "SARS-associated coronavirus". N Engl J Med 2003 May 15;348(20):1948-51。

冠狀病毒病毒顆粒示意圖全貌

S 蛋白結構模式

M 蛋白和 E 蛋白結構模式

N 蛋白結構模式

冠狀病毒入侵宿主細胞。冠狀病毒的 S 蛋白是介導冠狀病毒入侵宿主細胞的重要分子，

對其配體的研究亦成爲關心焦點。目前認爲有兩類分子可能是冠狀病毒的受體：氨基肽酶 N

（Aminopeptidase N）（圖 3a）以及鼠類癌胚抗原細胞黏附分子 1（murine CEACAM1）（圖

3b）。它們通過與冠狀病毒 S 蛋白結合，誘導冠狀病毒 S 蛋白髮生結構上的變化，暴露穿膜

有效結構域，介導病毒與宿主細胞發生膜融合，如圖 3c。

3a．氨基肽酶 N

3b. murine CEACAM1

3c．入侵過程

位於病毒顆粒中央的不規則核酸部分即病毒基因組，其上結合有核殼體蛋白(N蛋白，Nucleocapsid Protein)。冠狀病毒基因組 RNA(Genomic RNA)是一個無分段的，正義單鏈 RNA，長度一般在 27-31kb。該 RNA 鏈具有一個正鏈 RNA 病毒特有的重要結構特徵：即 RNA 鏈 5`端有甲基化帽(methylated cap)、3`端有 PolyA 尾的結構。這一結構，和真核mRNA 非常相近，也是其基因組 RNA 自身即可發揮翻譯模板作用的重要結構基礎。冠狀病毒進入細胞後的轉錄、翻譯、複製、裝配與出芽過程，如圖 4 所示。值得特別指出的是：冠狀病毒成熟粒子中，並不存在RNA病毒複製所需的 RNA 聚合酶(Viral RNA polymerase)。因此，它進入宿主細胞之後，首先將直接以病毒基因組 RNA 爲翻譯模板，表達出病毒 RNA 聚合酶。然後才利用該酶完成負鏈亞基因組 RNA (sub-genomic RNA)    的轉錄合成、各結構蛋白 mRNA 的合成，以及病毒基因組 RNA 的複製。另一個需要說明的特點是：冠狀病毒各個結構蛋白成熟的 mRNA 合成，並不存在轉錄後的修飾剪切過程，而是直接在初次轉錄過程中，通過  RNA  聚合酶和一些轉錄因子，以一種“不連續轉錄”(discontinuous  transcription)的機制，通過識別特定的轉錄調控序列（transcriptionregulating sequences  ，TSR），有選擇性地從負義鏈 RNA 上，一次性轉錄得到構成一個成熟 mRNA 的全部組成部分。

結構蛋白和基因組 RNA 複製完成後，將在宿主細胞內質網處裝配(assembly)生成新的冠狀病毒顆粒，並通過高爾基體分泌至細胞外，完成其生命週期。

圖 4.冠狀病毒細胞內複製模式圖

關於導致 SARS 的病原體，在其研究之初，全球各地的研究組曾經存在過多種推斷。3月22日，香港大學微生物系首先利用非洲綠喉腎臟細胞(African Green Monkey KidneyCells, Vero E6)，從一個感染者的肺組織中分離到了一種未知的病毒[參考資料] WHO. "SARS virus isolated, new diagnostic test producing reliable results". March 22,，推測其很可能即爲致病原。WHO 的研究網絡隨即集中對該病毒進行了分析，並且在3月27日的簡報中首次提到了”病原體可能是冠狀病毒的一種”[參考資料] WHO. "SARS virus close to conclusive identification, new tests for rapid diagnosis ready soon". March 27, 2003。此後兩週內，該研究網絡的多個實驗室對SARS進行了臨牀標本、病理組織與影像學、病毒分離培養、血清學與免疫學診斷、分子生物學與遺傳同源性等多方面的深入研究與鑑定[參考資料] J S M Peiris, S T Lai, L L M Poon etc. "Coronavirus as a possible cause of severe acute ". Lancet, Published online April 8, 2003[參考資料] Christian Drosten, Stephan Günther, Wolfgang Preiser etc. "Identification of a Novel ". NEJM, published at www.nejm.org on April 10, 2003.[參考資料] Thomas G. Ksiazek, Dean Erdman, Cynthia Goldsmith etc. "A Novel Coronavirus Associated ". NEJM, published at www.nejm.org on April 10,2003[參考資料] Susan M. Poutanen, Donald E. Low, Bonnie Henry etc. "Identification of Severe Acute ". NEJM, published at www.nejm.org on March 31, 2003，最終確認：一種新的冠狀病毒(Coronavirus)，

就是導致嚴重急性呼吸綜合徵的病原體！

SARS 冠狀病毒基因組學研究

[參考資料] . "[參考資料] Paul A. Rota,M. Steven Oberste, Stephan S. Monroe etc. "Characterization of a Novel Coronavirus Associated with Severe Acute Respiratory Syndrome". Science, www.sciencexpress.org, 1 May 2003". [參考資料] Marco A. Marra, Steven J. M. Jones,Caroline R. Astell etc. "The Genome Sequence of the ". Science, www.sciencexpress.org 1 May 2003[參考資料] QIN E’de, ZHU Qingyu, WANG Jian, LI Wei etc. "A complete sequence and comparative ". Chinese Science Bulletin 2003 Vol. 48 No.10 941-9484月12日，加拿大 British Columbia Cancer Agency’s Genome Sciences Centre 首先完成了SARS 冠狀病毒的全基因組測序(Accession Number: AY274119)。我國中國科學院華大基因組研究中心，也於4月16日完成了5個SARS病毒分離株的測序工作。截至5月9日，已提交到 GeneBank 的完整 SARS 基因組序列達11條。其基本信息見表 1。NCBI 參照上述各 序 列 ， 以Tor2基因組序列爲藍本 ， 修正給出了SARS的基因組參考序列(AC:NC_004718)。

表1.已完成測序的 SARS 冠狀病毒全基因組序列 （截至 2003.5.9）

通過與已知冠狀病毒基因組的比較分析，三個完成測序的研究組－USCCDC、加拿大BCCA 基因組研究所、北京華大基因組研究中心，分別基於 Urbani/Tor2/BJ01的序列，對 SARS冠狀病毒的基因組結構進行了分析預測，並發表了各自的工作。三個病毒株的分析結果基本一致，認爲 SARS 冠狀病毒基因組屬於典型的缺乏 HE 蛋白的冠狀病毒[HE(-)-Coronavirus]

基因組結構。其基因組 5’端約三分之二的區域，編碼病毒 RNA 聚合酶複合蛋白；後三分之一的區域，編碼病毒結構蛋白，按基因組上的排列順序依次爲 S 蛋白、E 蛋白、M 蛋白、N蛋白；未發現 HE 蛋白編碼序列。已發表的 USCDC、加拿大、北京華大的基因組結構圖分別如圖 5-7 所示。

圖 5.USCDC 基於 Urbani 冠狀病毒株基因組結構分析圖

圖 6.加拿大 BCCA 基因組研究所基於 Tor2 冠狀病毒株基因組結構分析圖

圖 7.中科院基因組中心基於 BJ01 冠狀病毒株基因組結構分析圖

上述三篇基因組分析論文10-12均指出在結構蛋白編碼區可能的開放讀碼框(Open Reading Frame, ORF)中，存在已有蛋白質序列數據庫中未找到任何同源序列的未知蛋白(Predicted Unknown Protein, PUP)。但是在具體的PUP數目和位置上，各組之間的結論存在一定的差異。其中USCDC對Urbani和北京華大對BJ01的分析，均報道發現了5個PUP；加拿大Tor2的分析則報道發現了9個可能的未知ORF和1個s2m motif。本研究在4月26日，即基於Genebank已有的基因組序列，參考 NCBI 的簡要註釋，對其進行了系統的同源性檢索分析，並在第一時間發佈，分析其結果與隨後發表的上述三篇論文基本一致20。現以加拿大Tor2的分析結果爲參照，將三地對於未知蛋白的結果羅列如下：

表2. Tor2 / Urbani /BJ01  基因組中未知蛋白 ORF 的預測對比

此外，加拿大和美國的研究組，均對冠狀病毒基因組的5’端非翻譯區(UTR)和各個 ORF起始密碼子上游的區域進行了分析，以期待尋找到類似於其他冠狀病毒”UCUAAAC”的，參與“不連續轉錄”識別的特徵性TRS（轉錄調控序列）。兩個研究組均在orf1a、S蛋白、X1(即 Tor2 ORF3 )、M 蛋白、X4（即 Tor2 ORF8）、X5(即 Tor2 ORF9)和 N 蛋白上游，發現了一個保守的8個核苷酸的 TRS――”AAACGAAC”。另外，加拿大的研究還顯示在其他幾個ORF上游，也有類似的TRS。(如表 3 所示)。上述發現，進一步支持了冠狀病毒的不連續轉錄模型，也爲ORF預測的準確性提供了強有力的證據。

表3.SARS 冠狀病毒轉錄調控序列位置及序列列表

另外，上述諸研究組的分析工作還發現了一些細節的結構現象。加拿大的研究提到在 3’端非編碼區，存在一個保守的 s2m motif。這個在某些病毒中廣泛存在的結構可能對於瞭解SARS 冠狀病毒的來源有提示作用[參考資料] Marco A. Marra, Steven J. M. Jones,Caroline R. Astell etc. "The Genome Sequence of the SARS-Associated Coronavirus". Science, www.sciencexpress.org 1 May 2003。中國 BJ01 的分析結果還發現了至少四個單位長度在 7個鹼基以上的迴文結構（palindromes）、140 多個可能形成髮夾結構(hairpin)的片段，以及發現 BJ01 基因組上 155-211/861-920 這兩個區域內的大約 60 個鹼基出現重複現象¹²。上述有趣的基因組現象的生物學意義均有待進一步研究證實。

SARS CoV 突變與 SARS 系統發生關係(Phylogenetic)分析

由於 SARS 是一種突發的嚴重傳染性疾病，短期內在多個國家均有感染及死亡報道。因此，分析比較不同地區 SARS 病毒的序列差異與突變狀況，對於瞭解疾病的傳染過程、病毒的毒力變化以及控制該疾病的傳播，都具有非常重要的意義。另外，運用比較基因組學的方法，瞭解 SARS 冠狀病毒與已知冠狀病毒的系統發生關係，以確定 SARS Coronavirus 的可能來源與種屬分類，也是 SARS 研究的重要課題。

本研究組於 4 月底，利用當時已發表的 9 個不同來源的 SARS 基因組序列，對其 S 蛋白的編碼區序列多樣性進行了分析，並以 S  蛋白質編碼基因爲對象，繪製出了序列已公佈的幾個 SARS 病毒株的系統發生樹[參考資料] Qipeng Zhang, Wei Rui, Lei Shi,Ming Lu. "The Preliminary Analysis of the Mutation of SARS Coronaviruses Genes' Sequences". CMBI，May 1, 2003。5 月 1 日，在北京基因組中心提交 BJ01 全基因組序列之後，隨即根據新的 5 條全基因組序列修正了上述 S 蛋白基因組序列突變分析，並進行了全基因組的鹼基替換與氨基酸突變分析[參考資料] Qipeng Zhang, Wei Rui, Lei Shi,Ming Lu. "The Attachment of Analysis of the Mutation of SARS Coronaviruses Genes'Sequences". CMBI，May 4, 2003[參考資料] Qipeng Zhang, Lei Shi, Wei Rui, Ming Lu.. "The Preliminary analysis of SARS associated Coronavirus Complete Genome's Mutation". CMBI，May 4, 2003。所得結果，與北京基因組中心隨後發表的論文所述基本一致(鹼基替換分佈如圖 8)。

圖 8. 已知 SARS 病毒株全基因組的鹼基替換分佈圖 (CMBI Modified, May 1,2003)

北京基因組中心在其發表的工作中，着重比較分析了 BJ01/Urbani/Tor2/CUHK/HKU 等五個病毒株全基因組的鹼基替換(substitution)情況及其對編碼氨基酸的影響。總共發現了31個鹼基替換位點， 計算總突變率約爲.0.10%； 其中有義突變(non-synonymous substitution)15個[參考資料] QIN E’de, ZHU Qingyu, WANG Jian, LI Wei etc. "A complete sequence and comparative analysis of a SARS-associated virus (Isolate BJ01)". Chinese Science Bulletin 2003 Vol. 48 No.10 941-948。具體突變的數目及分佈情況見表 4。

表 4. BJ01/Urbani/Tor2/CUHK/HKU 全基因組鹼基替換分析明細表

整體突變率顯示，不同地源的SARS冠狀病毒基因組，至少在上述病毒株採樣期間，保持了相對穩定。從絕對數量上看，突變部位主要集中在RNA聚合酶區域，但是考慮到突變ORF的長度，則顯示結構蛋白編碼區的突變率要大大高於聚合酶編碼區，未知蛋白質區域的突變率高於結構蛋白。這一結構上的突變分佈規律，與病毒功能上的穩定性具有一定的一致性。

上述突變規律的研究，對於SARS冠狀病毒的防治有着十分重要的意義：首先，RNA聚合酶的保守性，進一步證實了病毒 RNA 聚合酶合成的獨立性，也提示RNA聚合酶可能爲抗SARS藥物設計提供重要靶點。抗HIV藥物中的聚合酶抑制劑的成功思路，可能也適用於SARS冠狀病毒。其次，S蛋白質的突變，尤其是高比例的有義突變(3/4)，提示S蛋白可能是病毒誘發機體免疫系統生成抗體，及發生細胞毒性的T細胞免疫反應的主要抗原蛋白。這對於瞭解SARS的急性損傷機制，製備SARS冠狀病毒特異性抗體及疫苗，都有着十分重要的意義[參考資料] QIN E’de, ZHU Qingyu, WANG Jian, LI Wei etc. "A complete sequence and comparative analysis of a SARS-associated virus (Isolate BJ01) ". Chinese Science Bulletin 2003 Vol. 48 No.10 941-948。

另外，新加坡基因組中心於5月9日發表了對14條SARS全長或部分基因組序列的比較分析結果，對世界各地 SARS病毒的突變及演化關係進行了深入分析[參考資料] YiJun Ruan, Chia Lin Wei, Ling Ai Ee etc. "Comparative full-length genome sequence analysis of 14 SARS coronavirus isolates and common mutations associated with putative origins of infection". Lancet, Published online May 9, 2003。雖然由於其選用的BJ01的序列爲5月 1 日修正之前的數據，使得其突變分析結果有待改進，但是他們對於各地SARS病毒相互之間演化關係的推斷，還是具有相當重要的啓發意義和較高參考價值的。

從上述分析工作來看，SARS 冠狀病毒是一個比較穩定的病毒（但也不排除在未來其會有大規模的變異）。這個結果爲我們提供了喜憂參半的信息：其穩定性有利於機體針對病毒特異性抗體的生成，降低二次感染可能性，並增加了疫苗研究的可行性；但同時也意味着病毒隨傳代毒力減低的可能性減小，給疾病的流行控制增加了難度。當然，要回答“SARS 病毒變還是不變？怎麼變？”的問題，僅僅這些簡單而有限的分析是遠遠不夠的，還需要依賴於對不同地域、不同時間、不同感染者來源的更多病毒株的測序資料，以及更爲廣泛深入的臨牀與實驗研究。

在系統發生(Phylogenetic)方面，已知的冠狀病毒，根據血清學證據和種屬發生學規律，分爲 3 個 Group。其中 Group1，2 包括有多種哺乳動物冠狀病毒，Group3 僅有鳥感染性支氣管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus, IBV)。序列同源性的分析表明，SARS 冠狀病毒與已知各種冠狀病毒的同源性都不高[參考資料] Paul A. Rota,M. Steven Oberste, Stephan S. Monroe etc. "Characterization of a Novel Coronavirus Associated with Severe Acute Respiratory Syndrome". Science, www.sciencexpress.org, 1 May 2003（見表 5）。 

表 5. SARS 與已知冠狀病毒主要編碼蛋白氨基酸序列相似性比較分析結果 (USCDC)

因此，作爲一種新發現的冠狀病毒，確定SARS  CoV的系統發生學位置與種屬關係，是病毒學研究的重要課題。在缺乏血清學系統認證的情況下，前面提及的美、加、中三個研究組在發表各自基因組分析結果的同時，都基於核酸或冠狀病毒重要編碼蛋白的氨基酸序列，對SARS CoV進行了系統發生學分析(Phylogenetic Analyses)。北京研究組的系統發生樹，是基於Genebank中已有收載的17種不同的冠狀病毒 RNA 聚合酶的核酸和氨基酸序列；USCDC則利用全基因組序列已知的 7 種冠狀病毒的6個重要蛋白質氨基酸序列，繪製系統發生樹（見圖 9），加拿大的工作與USCDC基本類似[參考資料] Marco A. Marra, Steven J. M. Jones,Caroline R. Astell etc. "The Genome Sequence of the SARS-Associated Coronavirus". Science, www.sciencexpress.org 1 May 2003。上述工作均顯示SARS CoV無法歸於現有的任何一個Group，且在系統發生上與其他3個 Group 的成員基本上是等距離的。這一結果與序列同源比對的數據也是一致的。北京大學疾病基因研究中心生物信息組，在4月底也曾基於SARS CoV的S蛋白和orf1a序列，對其進行了同源比對和種系進化分析[參考資料] . "SARS 冠狀病毒預測蛋白的種系進化分析". 北京大學疾病基因研究中心 April 30, 2003，其結論得到了隨後發表論文的證實。

圖 9. USCDC 基於冠狀病毒主要編碼蛋白氨基酸序列的系統發生樹

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• SARS — Looking Back over the First 100 Days (N Engl J Med－7.24)
• SARS, What have we learned? (Nature－7.10)
• Coronavirus Genomic-Sequence Variations and the Epidemiology of the Severe Acute Respiratory Syndrome(N Engl J Med－7.10)

參考資料

SARS冠狀病毒基因組初步分析