3 概述
藥物敏感試驗簡稱藥敏試驗（或耐藥試驗）。旨在瞭解病原微生物對各種抗生素的敏感（或耐受）程度，以指導臨牀合理選用抗生素藥物的微生物學試驗。一種抗生素如果以很小的劑量便可抑制、殺滅致病菌，則稱該種致病菌對該抗生素“敏感”。反之，則稱爲“不敏感”或“耐藥”。爲了解致病菌對哪種抗菌素敏感，以合理用藥，減少盲目性，往往應進行藥敏試驗。其大致方法是：從病人的感染部位採取含致病菌的標本，接種在適當的培養基上，於一定條件下培養；同時將分別沾有一定量各種抗生素的紙片貼在培養基表面（或用不鏽鋼圈，內放定量抗生素溶液），培養一定時間後觀察結果。由於致病菌對各種抗生素的敏感程度不同，在藥物紙片周圍便出現不同大小的抑制病菌生長而形成的“空圈”，稱爲抑菌圈。抑菌圈大小與致病菌對各種抗生素的敏感程度成正比關係。於是可以根據試驗結果有針對性地選用抗生素。近年已有自動化的藥敏試驗儀器問世，使試驗更加迅速、準確。目前濫用抗生素，致使抗藥菌增加，甚至因長期大量使用廣譜抗生素，殺傷體內正常微生物，失去微生物的相互制約作用，從而使一些少見的或一般情況下的非致病菌大量繁殖，引起所謂“二次感染”的情況屢有發生，給治療造成人爲的困難。因此，提倡使用藥敏試驗，堅持合理用藥十分重要。
4 藥敏試驗分類
4.1 紙片擴散法
該法是將含有定量抗菌藥物的濾紙片貼在已接種了測試菌的瓊脂表面上，紙片中的藥物在瓊脂中擴散，隨着擴散距離的增加，抗菌藥物的濃度呈對數減少，從而在紙片的周圍形成濃度梯度。同時，紙片周圍抑菌濃度範圍內的菌株不能生長，二抑菌範圍外的菌株則可以生長，從而在紙片的周圍形成透明的抑菌圈，不同的抑菌藥物的抑菌圈直徑因受藥物在瓊脂中擴散速度的影響而可能不同，抑菌圈的大小可以反映測試菌對藥物的敏感程度，並與該藥物對測試菌的MIC呈負相關。
4.2 稀釋法
稀釋法藥敏試驗可用於定量測試抗菌藥物對某一細菌的體外活性，分爲瓊脂稀釋法和肉湯稀釋法。實驗時，抗菌藥物的濃度通常經過倍比（lg2）稀釋，能抑制待測菌肉眼可見生長的最低藥物濃度成爲最小抑菌濃度（MIC），一個特定抗菌藥物的測試濃度範圍應該包含能夠檢測細菌的解釋性折點（敏感、中介和耐藥）的濃度，同時也應該包含質控參考菌株的MIC.
4.2.1 瓊脂稀釋法
首先製備含抗菌藥物的瓊脂稀釋平板。再接種待測菌株，然後是結果判讀。
4.2.2 肉湯稀釋法
4.3 抗生素濃度梯度法
4.4 自動化儀器法
5 實驗步驟
5.1 實驗材料
普通營養瓊脂培養基：可去生化試劑店購買，做不同細菌的藥敏試驗可選擇不同的培養基，如做大腸桿菌的藥敏試驗可選擇普通營養瓊脂或麥糠凱培養基。做沙門氏菌可選擇血清培養基。
5.1.1 藥敏試紙
購買或自制（詳見實驗準備）
5.1.2 細菌
5.1.3 儀器
接種環、酒精燈、打孔器、牛津杯、移液器、滴頭
5.2 實驗準備
藥敏片的準備：購買或自制
製備方法：取新華1號定性濾紙，用打孔機打成6毫米直徑的圓形小紙片。取圓紙片50片放入清潔乾燥的青黴素空瓶中，瓶口以單層牛皮紙包紮。經15磅15-20分鐘高壓消毒後，放在37℃溫箱或烘箱中數天，使完全乾燥。
抗菌藥紙片製作：在上述含有50片紙片的青黴素瓶內加入藥液0.25毫升，並翻動紙片，使各紙片充分浸透藥液，翻動紙片時不能將紙片搗爛。同時在瓶口上記錄藥物名稱，放37℃溫箱內過夜，乾燥後即密蓋，如有條件可真空乾燥。切勿受潮，置陰暗乾燥處存放，有效期3-6個月。
藥液的製備（用於商品藥的試驗）：按商品藥的使用治療量的比例配製藥液；如商品藥百病消按其說明量治療量0.01%飲水，可按這個比例配製藥液，可取10毫克加入10毫升的水中混勻。此稀釋液即爲用於做藥敏試驗的藥液。
5.3 實驗操作方法
5.3.1 藥敏片法
在“超淨臺”中，用經（酒精燈）火焰滅菌的接種環挑取適量細菌培養物，以劃線方式將細菌塗布到平皿培養基上。具體方式；用滅菌接種環取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點塗菌，以每點開始劃線塗菌至平皿的1/2。然後，找到第二點劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細菌均勻密佈於平皿。（另：可挑取待試細菌於少量生理鹽水中製成細菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液塗布於平皿培養基表面。要求塗布均勻緻密）
將鑷子於酒精燈火焰滅菌後略停，取藥敏片貼到平皿培養基表面。爲了使藥敏片與培養基緊密相貼，可用鑷子輕按幾下藥敏片。爲了使能準確的觀察結果，要求藥敏片能有規律的分佈於平皿培養基上；一般可在平皿中央貼一片，外周可等距離貼若干片（外週一般可貼七片），每種藥敏片的名稱要記住。
將平皿培養基置於37℃溫箱中培養24小時後，觀察效果。
5.3.2 牛津杯法
在“超淨臺”中，用經（酒精燈）火焰滅菌的接種環挑取適量細菌培養物，以劃線方式將細菌塗布到平皿培養基上。具體方式；用滅菌接種環取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點塗菌，以每點開始劃線塗菌至平皿的1/2。然後，找到第二點劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細菌均勻密佈於平皿。（另：可挑取待試細菌於少量生理鹽水中製成細菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液塗布於平皿培養基表面。要求塗布均勻緻密。）
以無菌操作將滅菌的不鏽鋼小管（內徑6nm、外徑8nm、高10nm的圓形小管，管的兩端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培養基上，輕輕加壓，使其與培養基接觸無空隙，並在小管處標記各種藥物名稱。每個平板可放4-6支小管。待分鐘後，分別向各小管中滴加一定數量的各種藥液，勿使其外溢。置37℃培養8-18小時，觀察結果。
將平皿培養基置於37℃溫箱中培養24小時後，觀察效果。
5.3.3 打孔法
在“超淨臺”中，用經（酒精燈）火焰滅菌的接種環挑取適量細菌培養物，以劃線方式將細菌塗布到平皿培養基上。具體方式；用滅菌接種環取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點塗菌，以每點開始劃線塗菌至平皿的1/2。然後，找到第二點劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細菌均勻密佈於平皿。（另：可挑取待試細菌於少量生理鹽水中製成細菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液塗布於平皿培養基表面。要求塗布均勻緻密。）
以無菌操作將滅菌的不鏽鋼小管（外徑爲4毫米、孔徑與孔距均爲3毫米，管的兩端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培養基上打孔，將孔中的培養基用針頭挑出，並以火焰封底，使培養基能充分的與平皿融合（以防藥液滲漏，影響結果）。
加樣：按不同藥液加樣，樣品加至滿而不溢爲止。
將平皿培養基置於37℃溫箱中培養24小時後，觀察效果。
5.4 結果觀察
在塗有細菌的瓊脂平板上，抗菌藥物在瓊脂內向四周擴散，其濃度呈梯度遞減，因此在紙片周圍一定距離內的細菌生長受到抑制。過夜培養後形成一個抑菌圈，抑菌圈越大，說明該菌對此藥敏感性越大，反之越小，若無抑菌圈，則說明該菌對此藥具有耐藥性。其直徑大小與藥物濃度、劃線細菌濃度有直接關係。
5.5 判定標準
藥敏實驗的結果，應按抑菌圈直徑大小作爲判定敏感度高低的標準。
20以上 極敏
15~20 高敏
10~14 中敏
10以下 低敏
0 不敏
1，多黏菌素抑菌圈；在9毫米以上爲高敏，6—9毫米爲低敏，無抑菌圈爲不敏。
5.6 影響藥敏結果的因素
5.6.1 培養基
應根據試驗菌的營養需要進行配製。傾注平板時，厚度合適（約5-6mm），不可太薄，一般90mm直徑的培養皿，傾注培養基18-20ml爲宜。培養基內應儘量避免有抗菌藥物的拮抗物質，如鈣、鎂離子能減低氨基糖苷類的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和對氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺藥和TMP的活性。
5.6.2 細菌接種量
細菌接種量應恆定，如太多，抑菌圈變小，能產酶的菌株更可破壞藥物的抗菌活性。
5.6.3 藥物濃度
藥物的濃度和總量直接影響抑菌試驗的結果，需精確配製。商品藥應嚴格按照其推薦治療量配製。
5.6.4 培養時間
一般培養溫度和時間爲37℃ 8-18小時，有些抗菌藥擴散慢如多粘菌素，可將已放好抗菌藥的平板培養基，先置4℃冰箱內2~4小時，使抗菌藥預擴散，然後再放37℃溫箱中培養，可以推遲細菌的生長，而得到較大的抑菌圈。