血漿17α-羥孕酮

化驗及醫學檢查 性腺激素測定 激素類測定

心氣虛,則脈細;肺氣虛,則皮寒;肝氣虛,則氣少;腎氣虛,則泄利前後;脾氣虛,則飲食不入。
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1 拼音

xuè jiāng 17-qiǎng yùn tóng

2 英文參考

Plasma 17α - hydroxy progesterone

Plasma 17α-OHP

3 概述

17α-羥孕酮(17-α-hydoxy progesterone,17α-OHP)由腎上腺皮質性腺產生,其孕酮活性很低。17α-OHP經21-羥化生成皮質醇的前體化合物S(CpS)。17α-OHP具有與腎上腺皮質醇相一致的晝夜節律變化。成年育齡婦女17α-OHP濃度隨月經週期而變化,黃體期高於卵泡期妊娠胎兒胎盤腎上腺可產生大量17α-OHP。妊娠32周後17α-OHP濃度急劇升高直到分娩期,17α-OHP也存在於新生兒臍帶血中。

4 血漿17-羥孕酮醫學檢查

4.1 檢查名稱

血漿17α-羥孕酮

4.2 分類

激素類測定 > 性腺激素測定

4.3 取材

血液

4.4 血漿17-羥孕酮的測定原理

本法是標記抗原(Ag·)和非標記抗原(Ag)對特異性抗體(Ab)的競爭抑制反應,其反應爲Ag·+Ag+Ab(Ag·Ab)+(AgAb)。當Ag·和Ab的量保持恆定,Ag與Ag·之和大於Ab上的有效結合點的數目,在該條件下,Ag與Ag·間存在着函數關係,亦即隨着Ag濃度增加,Ag-Ab生成量多,而Ag·-Ab的數量則減少,遊離的Ag·就增多。因爲Ag·對Ab的結合,可因Ag競爭結合而遭抑制。反之,當Ag量少時,Ag-Ab生成量就少,Ag·-Ab量增多,而遊離的Ag·減少(圖1)。將結合的抗原抗體複合物(B)與遊離抗原(F)分離,分別測定B和F的放射活性,計算出B/F或B/B+F值,可製出B/F或B/B+p對Ag量的關係曲線圖。測定時,需用一系列已知濃度的Ag和一定量Ag·及相應抗體Ab混合,然後測出各標準濃度Ag參加下的Ag·-Ab放射結合率(B/B+F)或(B/F),繪出競爭抑制標準曲線(圖2)。試驗時,在同樣條件下,根據被測Ag的放射性結合率,從標準曲線上查知相應Ag含量。

4.5 試劑

(1)抗原的純化:試驗需用高純度的抗原。通常,蛋白質抗原的純度應達到電泳分析純,電泳後僅顯示單一區帶,並具有足夠或完整的免疫原性。一般先經聚丙烯酰胺電泳鑑定,再用等電聚焦SDS聚丙烯酰胺雙相電泳鑑定爲單一區帶,然後用於免疫動物核素標記。

抗原因其溶液中缺乏其他蛋白質穩定劑,或因貯存在純離子濃度的緩衝液中,故易形成聚合物,因此在純化抗原時需加注意。若採用聚合物抗原的標記,用於RIA中將會顯著增加非特異性結合,降低測定的靈敏度

(2)抗原的標記方法:標記用的核素有γ射線和β射線兩大類。前者常用131I、125I、51Cr,後者多用3H、32P和14C。選擇放射性核素首先要考慮比放射性,比放射性愈高,參與反應抗原化學量就愈小,測定方法靈敏度相對就愈高。核放射性和半衰期要適宜,便於使用和防護。標記後的抗原保持免疫原性。標記技術要簡便、經濟。

標記方法有直接標記和間接標記兩大類,以最常用的125I爲例分述如下。

①直接標記:將125I直接結合於蛋白質側鏈殘基的酪氨酸上,步驟單一,操作簡便,標記物的比放射性較高,但此法僅能用於標記含酪氨酸化合物,如所含的酪氨酸殘基爲蛋白質特異性和生物活性所必需,則該活性易因標記而失活。

最常用的直接標記法爲氯胺T標記法(簡稱h-T):氯胺T是對甲基苯磺基酰胺的N氯衍生物的鈉鹽,在水溶液分解形成次氯酸成爲一種氧化劑。在偏鹼溶液中(pH值7.5)能使帶負電荷的125I離子(Na-125I)氧化成帶正電荷的125I離子,藉以取代蛋白質酪氨酸苯環的氫,形成二碘酪氨酸

125I標記率的高低與抗原蛋白質多肽分子酪氨酸的含量及其在分子中的暴露程度有關。

標記方法的原則是將純化抗原125I加入小試管底部,繼將配製的氯胺T快速衝入,混勻振盪1~2min後加入偏重亞硫酸鈉終止反應。再加碘化鉀溶液稀釋,然後葡聚糖G50柱上分離,分別用井型閃爍計數器測定放射性強度(脈衝數/min、cpm),前部爲標記抗原峯,後部爲遊離125I峯。在標記抗原峯試管中加等量1%白蛋白作爲穩定劑即爲標記抗原液。

②間接標記:是先將125I標記在載體上,純化後再與蛋白質或肽抗原結合,用N琥珀酰亞胺-3-[4-羥5-(125I)碘苯]丙酸鹽(NSHPP)作爲間接標記試劑,該試劑的N琥珀酰亞胺基與多肽遊離氨基縮合爲結合物,使125I標記的苯基與蛋白質氨基結合。

本法先以氯胺T使125I接上NSHPP,由於在水溶液中它迅速水解爲3-(4-羥苯基)丙酸,故在碘化反應中要儘快減少這種水解作用。這種碘標記物必須從水箱抽提到有機溶液中去,再除去有機溶劑後,使125I-NSHPP與蛋白質結合,製成125I-NSHPP-蛋白質標記物。

本法可標記缺乏酪氨酸殘基的多肽,其最大優點是不損傷蛋白質的活性,能保存標記物高度的酶活性免疫活性,適合於對不穩定蛋白質標記,缺點是操作複雜,標記率低。

(3)標記抗原鑑定:爲保證放射免疫測定的質量,製備的標記物必需作如下鑑定

遊離放射性碘的含量  用三氯乙酸將所有蛋白質沉澱,分別測定沉澱物和上清液的cpm值。一般要求遊離碘佔總放射性碘的5%以下。標記抗原貯存過久時,可出現標記物的解離,一旦超過5%則應廢棄。

免疫活性  用小量標記抗原加過量抗體反應分離B和F,分別測定其放射性,算出百分結合率,此值應在80%以上,值越大,表示損傷抗原越少。

放射強度  它是指單位重量抗原的放射強度,比放射性越高,測定越敏感。標記抗原的比放射性以125I的標記率或利用率表示。

(4)抗體的製備和鑑定  RIA中所用的抗體應具有高親和力和高特異性,製備高價單相抗血清,最好以標記用的純化抗原免疫動物,製備半抗原抗血清,需先將半抗原載體結合,使成免疫原,常用的載體牛血白蛋白

抗血清同樣也要加以嚴格鑑定,包括其靈敏度、親和力和特異性。在固定量標記抗原與不同濃度的抗血清作用的條件下,測定B/F值,製得一條B/F值對不同稀釋度抗血清的曲線圖(圖3),該曲線的直線部分上段的斜率是抗體最大親和力的定性標誌,也是靈敏度的標誌。斜率越大,RIA靈敏度越高,在許多RIA反應系統中,呈最大靈敏度抗體濃度爲B/F=1。

當採用固定量的抗體(Q0)與不同濃度的抗原作用時,以B/F對B作圖,所得曲線的斜率就是親和常數(Ka)的負數(圖4)。

在RIA反應系統中,測定結構相似的不同物質時,可以鑑定抗體特異性

4.6 操作方法

本法分三個步驟,即抗原抗體反應、B和F分離和放射性測定。

(1)抗原抗體反應:將標本(非標記抗原)、標記抗原抗血清順序定量加入小試管內,置室溫(15~30℃)作用24h,使其充分競爭結合。

(2)B、F分離分離技術多種多樣,常用沉澱法。①第二抗體沉澱法:又稱雙抗體法,在受檢抗原與第一抗體特異性反應後加入相應的第二抗體,使形成的抗原-第一抗體-第二抗體的複合物共沉,一經離心即可使結合標記抗原B與遊離抗原F分離。本法是特異性沉澱,分離完全,非特異性結合力低。但第二抗體用量較大,成本較高。此外血清濃度、抗凝劑的有無因素可在一定程度上影響結果。②聚乙二醇(PEG)沉澱法:使蛋白質處於等電點狀態,水化層破壞而導致蛋白質沉澱。本法優點是PEG製備方便、價廉、分離快速,缺點是非特異沉澱物較多,分離不完全。③第二抗體-聚乙二醇沉澱法:本法既有PEG法的快速沉澱優點,且保持第二抗體特異性沉澱的作用,又減少第二抗體用量,並降低PEG濃度,使非特異沉澱物減少。④活性炭吸附法:利用活性炭表面活性將小分子的遊離部分吸附。如在活性炭表面塗上一層葡聚糖,使它表面具有一定孔徑的網眼,從而允許小分子游抗原半抗原逸入而被吸附,而大分子複合物則被排斥在外。在抗原抗體反應後,加入葡聚糖-活性炭,放置5~10min,使遊離抗原吸附活性炭顆粒上,離心使顆粒沉澱,上清液中含有結合的標記抗原

(3)放射性強度測定:B和F分離後,即可測定其放射性強度。測量儀器有兩類:液體閃爍計數儀(測β射線)和晶體閃爍計數儀(測γ射線)。計數單位是探測器輸出的電脈衝數,單位爲cpm(脈衝數/min)。

每次測定均需作一標準曲線圖,以標準抗原的不同濃度爲橫座標,以測到的相應放射性強度爲縱座標作圖。放射性強度可任選B或F,亦可採用計算值B/B+F、B/F或B/B0標本應作雙份測定,取其平均值,在標準曲線上查出相應的受檢抗原濃度。

4.7 正常值

育齡女性:卵泡期0.1~0.8ng/ml;黃體期0.27~2.9ng/ml;妊娠末3個月2~12ng/ml。

男性:0.31~2.13ng/ml。

4.8 化驗結果臨牀意義

21-羥化酶缺乏的先天腎上腺皮質增生患者血17α-OH-P濃度明顯升高,11-羥化酶缺乏時17α-OH-P上升幅度較小。約6%的成年多毛女性有不同程度的21-羥化酶缺乏。這一類遲髮型缺乏症病例中17P濃度常超過卵泡期的高限0.9NG/ML。17α-OH-P的測定也用於分析男性和女性的普通痤瘡、男性禿頂及一些不明原因的不育症

4.9 附註

使用藥物氯米芬可使孕酮測定結果升高,使用氨苄西林、口服避孕藥可使孕酮水平降低。

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