3 概述
血管緊張素轉換酶(ACE)又稱激肽酶Ⅱ或肽基-羧基肽酶,系統命名爲肽基-二肽水解酶。屬血管內皮細胞膜結合酶,由肽的C端將氨基酸切爲兩段變換而來,可使肽鏈C端二肽殘基水解。ACE可催化血管緊張素Ⅰ(十肽)水解成八肽的血管緊張素Ⅱ,使血管進一步收縮,血壓升高。也可作用於腎上腺皮質,促進醛固酮的分泌。因此,ACE是腎素-血管緊張素-醛固酮的重要成分。ACE還催化具有降壓作用的緩激肽水解而失去活性。ACE廣泛分佈於人體各組織,以附睾、睾丸及肺的含量較豐富,其中肺毛細血管內皮細胞ACE活性最高。腎、腦垂體等組織酶活性較低。ACE測定方法主要有比色法、酶偶聯法等。
5 血管緊張素轉化酶的醫學檢查
5.1 檢查名稱
5.2 分類
5.3 取材
5.4 血管緊張素轉化酶的測定原理
(1)三硝基苯磺酸鈉(INBS)顯色法:底物馬尿酰-甘氨酰-甘氨酸(Hip-Gly-Gly)在ACE作用下,釋放出甘氨酰-甘氨酸(Gly-Gly),後者與三硝基苯磺酸(TNBS)作用,生成黃色的三硝基苯-甘氨酰-甘氨酸(TNP-Gly-Gly),其含量與ACE活性呈正相關。
(2)酶偶聯法:ACE使底物馬尿酸雙甘肽(Hip-Gly-Gly)水解成馬尿酸(Hip)和雙甘肽(Gly-Gly),後者與L-γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺(GGCN)和γ-谷氨酰基轉移酶(GGT)偶聯,形成3-羧基-4-硝基苯胺,在340nm處測其吸光度,以反映ACE活性。
5.5 試劑
(1)三硝基苯磺酸鈉(INBS)顯色法:
①底物液:用5mmol/L的Tris溶液配製30mmol/L HGG溶液,此液中含0.4mol/L Na2SO4、0.3mol/L NaCl,調pH7.3。
③100g/L鎢酸鈉(含2個水)溶液。
④0.33mol/L NaSO4。
⑤60mmol/L TNBS溶液。
⑥40mmol/L Gly-Gly。
(2)酶偶聯法:
①50mmol/L HEPES緩衝液:稱羥、乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)1.191g,加雙蒸餾水100ml溶解,用於配製GGT、CGCN和基質緩衝液。
②20kU/L GGT貯存液:取HEPES緩衝液5ml,加入GGT 100U,混勻後分裝小瓶,-20℃保存。
③6.7kU/L GGT應用液:將上述貯存液用二倍量的HEPES稀釋配製。
④0.1mmol/L GGCN溶液:稱GGCN 20mg,加入50mmol/L HEPES 60ml,溶解後4℃保存。
⑤基質緩衝液:稱HEPES 1.191g,NaCl 1.755g,Na2SO45.68g,用雙蒸餾水溶解後,用NaOH調pH至8.0,再補充雙蒸餾水至100ml,4℃保存。
⑥基質液:由Hip-Gly-Gly 89.5mg加基質緩衝液10ml溶解混合而成。此液各試劑終濃度爲:HEPES 50mmol/L,NaCl 30mmol/L,Na2SO4400mmol/L,Hip-Gly-Gly 30mmol/L。
⑦10mmol/L雙甘肽標準液:稱Gly-Gly 52.9mg加雙蒸餾水溶解,並稀釋至100ml,此爲貯存液(40mmol/L)。1份貯存液和3份雙蒸餾水混合即爲應用液。
5.6 操作方法
(1)三硝基苯磺酸鈉(INBS)顯色法:取試管2支,標明空白管(B)和測定管(U),各加血清0.01ml,B管加試劑(1)、(3)、(4),U管加底物0.1ml,置37℃水浴30min;U管加試劑(3)、(4)各0.1ml,然後B、U管各加蒸餾水1.0ml,混勻;1500g離心10min,各取上清液0.75ml,分別加入試劑(2)1.0ml及TNBS 0.05ml,室溫30min或37℃ 15min,用5mm比色杯,在420nm處,B管調零,讀取U管吸光度。
(2)酶偶聯法:取小試管4支,分別標明測定管(U),標準管(S),血清空白管(SB),試劑空白管(RB)。按表1操作。
混勻,以雙蒸餾水調零點,410nm波長比色,記錄各管2min吸光度△A值。
5.7 正常值
(1)三硝基苯磺酸鈉(INBS)顯色法:26.1~56.7kU/L。
(2)酶偶聯法:289±83U/L。
5.8 化驗結果臨牀意義
血清ACE測定主要同於肺部疾病的診斷,對其他系統疾病的診療也有一定
價值。
(1)肺部疾病:絕大多數結節病患者血清ACE活力升高,其陽性率及幅度與病情活動與否和病變累及的範圍有關。肺結核也可升高,而哮喘發作、急性心原性肺水腫、慢性阻塞性肺疾患、自發性氣胸、肺纖維化、成人呼吸窘迫綜合徵等血清ACE均有不同程度下降。
(2)肝臟疾病:多數肝臟病患者ACE活性升高,升高幅度依次爲肝硬化、急性肝炎、慢性肝炎。脂肪肝則正常。
(3)甲狀腺疾病:甲亢患者ACE活性明顯高於其他甲狀腺疾病,且酶活力高低與T3、T4含量呈正相關。
(4)其他:糖尿病、虹膜炎、免疫母細胞肉瘤等,血清ACE升高;高血壓、結腸炎等則降低。
5.9 附註
(1)三硝基苯磺酸鈉(INBS)顯色法:
①標本在室溫或冰箱存放1周,酶活力無明顯變化,-15℃保存3周酶活性穩定。
②膽紅素對ACE有明顯抑制作用,故重度黃疸可使測定結果偏低。EDTA是ACE的強抑制劑,NaCl和Na2SO4對ACE有明顯的活化作用,溶血、脂血對結果無影響。
③本法與紫外分光光度法酶活力單位一致,但其測得值爲紫外法的9倍。
(2)酶偶聯法:
①當底物pH 8.0,GGCN 1.0mmol/L,GGT6.7ku/L時,ACE活性與吸光度值有良好線性。線性範圍大,即使ACE在1500U/L,不用稀釋也可獲得理想結果。
②GGCN濃度選擇:本反應體系中GGCN既是測定酶ACE的受體,又是指示酶GGT的供體。以1.0mmol/L的GGCN最理想,在此濃度下GGCN與吸光度保持良好的線性。
③GGT對測定的影響:本反應利用GGT將雙甘肽與GGCN偶聯,生成黃色的3-羧基-4-硝基苯胺,其加入量可直接影響測定結果。GGT高濃度可使底物過度消耗,使吸光度偏離曲線;低濃度GGT又使吸光度偏低,靈敏度不高。每次加入0.335 U GGT,可獲得理想吸光度與線性。在此濃度下,酶基質液的空白管吸光度<0.1A。