2 英文參考
radioimmunoassay，RIA
3 概述
放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）是以放射性核素爲標記物的標記免疫分析法，用於定量測定受檢標本中的抗原。最初建立的方法模式是以核素標記的抗原與受檢標本中抗原競爭的測定模式，爲區別於前者，稱爲免疫放射分析（immunoradiometricassay，IRMA）。兩種方法均在醫學檢驗中得到了廣泛應用。
放射免疫分析是由Yalow和Berson於1960年創建的標記免疫分析技術。由於標記物放射性核素的檢測靈敏性，本法的靈敏度高達ng甚至pg水平。測定的準確性良好，ng量的回收率接近100％。本法特別適用於微量蛋白質、激素和多肽的定量測定。
4 放射免疫分析的基本原理
放射免疫分析的基本原理是標記抗原（Ag*）和非標記抗原（Ag）對特異性抗體（Ab）的競爭結合反應。它的反應式爲：
在這一反應系統中，作爲試劑的標記抗原和抗體的量是固定的。抗體的量一般取用能結合40％～50％的標記抗原，而受檢標本中的非標記抗原是變化的。根據標本中抗原量的不同，得到不同的反應結果。
4（Ag*）＋2（Ab）→2（Ag*Ab）＋2（Ag*）（2）
4（Ag*）＋4（Ag）＋（2Ab）→
1（Ag*Ab）＋3（Ag*）＋1（AgAb）＋3（Ag）（3）
當標記抗原、非標記抗原和特異性抗體三者同時存在於一個反應系統時，由於標記抗原和非標記抗原對特異性抗體具有相同的結合力，因此兩者相互競爭結合特異性抗體。由於標記抗原與特異性抗體的量是固定的，故標記抗原抗體複合物形成的量就隨着非標記抗原的量而改變。非標記抗原量增加，相應地結合較多的抗體，從而抑制標記抗原對抗體的結合，使標記抗原抗體複合物相應減少，遊離的標記抗原相應增加，亦即抗原抗體複合物中的放射性強度與受檢標本中抗原的濃度呈反比（圖16-1）。若將抗原抗體複合物與遊離標記抗原分開，分別測定其放射性強度，就可算性結合態的標記抗原（B）與遊離態的標記抗原（F）的比值（B/F），或算出其結合率[B/（B＋F）]，這與標本中的抗量呈函數關係。用一系列不同劑量的標準抗原進行反應，計算相應的B/F，可以繪製出一條劑量反應曲線（圖16-2）。受檢標本在同樣條件下進行測定，計算B/F值，即可在劑量反應曲線上查出標本中抗原的含量。
圖16-1 放射免疫分析原理示意圖
4.1 （一）標記物
標記用的核素有放射γ射線和β射線兩大類。前者主要爲131I、125I、57Cr和60Co；後者有14C、3H和32P。放射性核素的選擇首先考慮比活性。例如125I比活性的理論值是64.38×104GBq/g（1.74×104Ci/g），有較長半衰期的14C最大比活性是166.5GBq/g（4.5Ci/g）。兩者相比，1mol125I或14C結合到抗原上，125I的敏感度約比14C大3900倍。又因爲125I有合適的半衰期，低能量的γ射線易於標記，因而125I是目前常用的RIA標記物。
4.2 （二）標記方法
標記125I的方法可分兩大類，即直接標記法和間接標記法。
直接標記法是將125I直接結合於蛋白質側鏈殘基的酪氨酸上。此法優點是操作簡便，爲125I和蛋白質的單一步驟的結合反應，它能使較多的125I結合在蛋白質上，故標記物具有高度比放射性。但此法只能用於標記含酪氨酸的化合物。此外，含酪氨酸的殘基如具有蛋白質的特異性和生物活性，則該活性易因標記而受損傷。
間接標記法（又稱連接法）是以125I標記在載體上，純化後再與蛋白質結合。由於操作較複雜，標記蛋白質的比放射性顯著低於直接法。但此法可標記缺乏酪氨酸的肽類及某些蛋白質。如直接法標記引起蛋白質酪氨酸結構改變而損傷其免疫及生物活性時，也可採用間接法。它的標記反應較爲溫和，可以避免因蛋白質直接加入125I液引起的生物活性的喪失。下面介紹最常用的氯胺T直接標記法。
氯胺T是對甲苯磺基酰胺的N-氯衍生物的鈉鹽，在水溶液中逐漸分解形成次氯酸，是一種氧化劑。在偏鹼溶液中（pH7.5），氯胺T將125I的I－氧化爲I+，I+取代蛋白質酪氨酸苯環的氫，形成二碘酪氨酸。反應式如下：
放射性碘標記率的高低與抗原（蛋白質或多肽）分子中酪氨酸的含量及分子中酪氨酸的暴露程度有關，當分子中含有較多的酪氨酸，又暴露在外時，則標記率就高。
標記方法：將純化抗原和125I加入小試管底部，然後將新鮮配製的氯胺T快速衝入，混勻振盪數十秒～2min後加入偏重亞硫酸鈉終止反應。再加入KI溶液稀釋。然後在葡聚糖G柱上分離，逐管收集。分別用井型閃爍計數器測定放射性強度（脈衝數/min,cpm），前部爲標記抗原峯，後部爲遊離125I峯。在標記抗原峯試管內加等量1％白蛋白作穩定劑，此即爲標記抗原液。
4.3 （三）標記物的鑑定
1．放射性遊離碘的含量用三氯醋酸（預先在受鑑定樣品中加入牛血清白蛋白）將所有蛋白質沉澱，分別測定沉澱物和上清液的cpm值。一般要求遊離碘在總放射性碘的5％以下。標記抗原在貯存過久後，會出現標記物的脫碘，如遊離碘超過5％則應重新純化去除這部分遊離碘。
2．免疫活性標記時總有部分抗原活性損失，但應儘量避免。檢查方法是用小量的標記抗原加過量的抗體，反應後分離B和F，分別測定放射性，算出BT％。此值應在80％以上，該值越大，表示抗原損傷越少。
3．放射性比度標記抗原必須有足夠的放射性比度。比度或比放射性是指單位重量抗原的放射強度。標記抗原的比放射性用mCi/mg（或mCi/mmol）表示。比度越高，測定越敏感。標記抗原的比度計算是根據放射性碘的利用率（或標記率）：
如：5μghGH用2mCiNa125I進行標記，標記率爲40％，則
4.4 （四）抗血清的檢定
含有特異性抗體的抗血清是放射免疫分析的主要試劑，常以抗原免疫小動物誘發產生多克隆抗體而得。抗血清的質量直接影響分析的靈敏度和特異性。抗血清質量的指標主要有親和常數、交叉反應率和滴度。
1．親和常數親和常數（affinityconstant）常用K值表示。它反映抗體與相應抗原的結合能力。K值的單位爲mol/L，即表示1mol抗體稀釋至若干L溶液中時，與相應的抗原結合率達到50％。抗血清K值越大，放射免疫分析的靈敏度、精密和準確度越佳。抗血清的K值達到109～1012mol/L才適合用於放射免疫分析。
2．交叉反應率放射免疫分析測定的物質有些具有極爲類似的結構，例如甲狀腺素的T3、T4，雌激素中的雌二醇、雌三醇等。針對一種抗原的抗血清往往對於其類似物會發生交叉反應。因此交叉反應率反映抗血清的特異性，交叉反應率過大將影響分析方法的準確性。交叉反應率的測定方法爲用與抗血清相應抗原及其類似物用同法進行測定，觀察置換零標準管50％時的量。以T3抗血清爲例，置換零標準50％T3爲1ng，其類似物T4則需200ng，則其交叉反應率爲：1/200＝0.5％。
3．滴度滴度係指將血清稀釋時能與抗原發生反應的最高稀釋度。它反映抗血清中有效抗體的濃度。在放射免疫分析中滴度爲在無受檢抗原存在時，結合50％標記抗原時抗血清的稀釋度。
5 放射免疫分析的測定方法
用放射免疫分析進行測定時分三個步驟，即抗原抗體的競爭抑制反應、B和F的分離及放射性的測量。
5.1 （一）抗原抗體反應
將抗原（標準品和受檢標本）、標記抗原和抗血清按順序定量加入小試管中，在一定的溫度下進行反應一定時間，使競爭抑制反應達到平衡。不同質量的抗體和不同含量的抗原對溫育的溫度和時間有不同的要求。如受檢標本抗原含量較高，抗血清的親和常數較大，可選擇較高的溫度（15～37℃）進行較短時間的溫育，反之應在低溫（4℃）作較長時間的溫育，形成的抗原抗體複合物較爲牢固。
5.2 （二）B、F分離技術
在RIA反應中，標記抗原和特異性抗體的含量極微，形成的標記抗原抗體複合物（B）不能自行沉澱，因此需用一種合適的沉澱劑使它徹底沉澱，以完成與遊離標記抗原（F）的分離。另外對小分子量的抗原也可採取吸附法使B與F分離。
1．第二抗體沉澱法這是RIA中最常用的一種沉澱方法。將產生特異性抗體（第一抗體）的動物（例如兔）的IgG免疫另一種動物（例如羊），製得羊抗兔IgG血清（第二抗體）。由於在本反應系統中採用第一、第二兩種抗體，故稱爲雙抗體法。在抗原與特異性抗體反應後加入第二抗體，形成由抗原－第一抗體－第二抗體組成的雙抗體複合物。但因第一抗體濃度甚低，其複合物亦極少，無法進行離心分離，爲此在分離時加入一定量的與一抗同種動物的血清或IgG，使之與第二抗體形成可見的沉澱物，與上述抗原的雙抗體複合物形成共沉澱。經離心即可使含有結合態抗原（B）的沉澱物沉澱，與上清液中的遊離標記抗原（F）分離。
將第二抗體結合在顆粒狀的固相載體之上即成爲固相第二抗體。利用固相第二抗體分離B、F，操作簡便、快速。
2．聚乙二醇（PEG）沉澱法最近各種RIA反應系統逐漸採用了PEG溶液代替第二抗體作沉澱劑。PEG沉澱劑的主要優點是製備方便，沉澱完全。缺點是非常特異性結合率比用第二抗體爲高，且溫度高於30℃時沉澱物容易復溶。
3．PR試劑法是一種將雙抗體與PEG二法相結合的方法。此法保持了兩者的優點，節省了兩者的用量，而且分離快速、簡便。
4．活性炭吸附法小分子游離抗原或半抗原被活性炭吸附，大分子複合物留在溶液中。如在活性炭表面塗上一層葡聚糖，使它表面具有一定孔徑的網眼，效果更好。在抗原與特異性抗體反應後，加入葡聚糖－活性炭。放置5～10min，使遊離抗原吸附在活性炭顆粒上，離心使顆粒沉澱，上清液中含有結合的標記抗原。此法適用於測定類固醇激素，強心糖苷和各種藥物，因爲它們是相對非極性的，又比抗原抗體複合物小，易被活性炭吸附。
5.3 （三）放射性強度的測定
B、F分離後，即可進行放射性強度測定。測量儀器有兩類，液體閃爍計數儀（β射線，如3H、32P、14C等）和晶體閃爍計數儀（β射線，如125、131I、57Cr等）。
計數單位是探測器輸出的電脈衝數，單位爲cpm（計數/分），也可用cps（計數/秒）表示。如果知道這個測量系統的效率，還可算出放射源的強度，即dpm（衰變/分）或dps（衰變/秒）。
每次測定均需作標準曲線圖，以標準抗原的不同濃度爲橫座標，以在測定中得到的相應放射性強度爲縱座標作圖（圖16-3）。放射性強度可任選B或F，亦可用計算值B/（B＋F）、B/F和B/B0。標本應作雙份測定，取其平均值，在製作的標準曲線圖上查出相應的受檢抗原濃度。
圖16-3 放射免疫分析標準曲線示例
6 放射免疫分析在醫學檢驗中的應用
放射免疫分析由於敏感度高、特異性強、精密度高、並可測定小分子量和大分子量物質，所以在醫學檢驗中應用極爲廣泛，常用於測定各種激素（如甲狀腺激素、性激素、胰島素等）、微量蛋白質、腫瘤標誌物（如AFP、CEA、CA-125、CA-199等）和藥物（如苯巴比妥、氯丙嗪、慶大黴素等）等。各種檢測項目均有試劑盒供應，而且儀器設備並不昂貴，所以在國內被廣泛採用。但由於核素的放射性對人體有一定的危害性，必須加以防護，核素實驗室的建設須經防疫部門的監督，操作人員須經過特殊訓練。另外由於核素有半衰期，試劑盒的貨存期較短，因而放射免疫分析在應用中有諸多不便之處。特別是近年來其他標記免疫分析技術如酶免疫分析、發光免疫分析等在技術上有飛躍的進展，高級儀器的自動化程度已可與生化自動分析儀相媲美，因此從長遠前景看，放射免疫分析有被取代的趨勢。但在目前，從所需的設備和檢測的費用上，放射免疫分析還有一定的優越性，還將在一定時期內被醫學檢驗實驗室所採用。