2 英文參考
haemophilus ducreyi[WS/T 191—2017 軟下疳診斷]
3 概述
杜克雷嗜血桿菌（haemophilus ducreyi）爲兼性厭氧菌，由Ducrey 1889年在意大利發現。杜克雷嗜血桿菌無運動能力，無芽胞，革蘭染色陰性，短桿狀，兩端鈍圓，長1.6μm～2μm，寬0.5μm，大多數在細胞外呈鏈狀或魚羣狀排列，少數在細胞內呈團狀分佈[1]。
4 杜克雷嗜血桿菌的實驗室檢查方法
4.1 標本採集
4.1.1 取材工具
棉拭子或藻酸鈣拭子。
4.1.2 取材部位
4.1.3 皮膚黏膜損害取材
用無菌棉拭子輕輕擦去潰瘍表面的痂皮和污物，再用拭子採取分泌物，從潰瘍基底部或邊緣取材，做塗片檢查或培養。
4.1.4 淋巴結取材
選有波動的淋巴結，消毒淋巴結表麪皮膚，用無菌幹棉球擦乾。用ImL無菌注射器配12號針頭，吸取生理鹽水0.25 mL～0.5 mL，以無菌操作穿刺淋巴結並注入鹽水，再吸入注射器內，反覆2次～3次後，取抽吸液做塗片檢查或培養。
4.2 顯微鏡檢查
4.2.1 材料
4.2.2 方法
將標本均勻輕輕地塗在乾淨的玻片上，然後在空氣中乾燥，火焰固定。
4.2.3 革蘭染色
操作步驟如下：
a） 將經過固定的塗片鋪滿結晶紫溶液，染30 s～60 s，迅速在流水中洗淨。
b） 用碘液鋪滿塗片，染30 s～60 s，用流水洗淨。
c） 用丙酮一乙醇液脫色，直到塗片無紫色脫下爲止。通常要10 s～20 s，取決於塗膜的厚薄。避免脫色過分，否則革蘭陽性菌可誤認爲陰性菌。很快在流水中淋洗停止脫色，將過量的水用吸水紙吸乾。
d） 用復紅液復染1 min，用流水淋洗，用吸水紙吸乾。
4.2.4 結果及解釋
使用10×100倍油鏡檢查。
杜克雷嗜血桿菌爲革蘭染色陰性，短桿狀，兩端鈍圓，長1.6 μm～2μm，寬0.5μm，大多數在細胞外呈鏈狀或魚羣狀排列，少數在細胞內呈團狀分佈。
因生殖器潰瘍中常有多種微生物寄居，臨牀標本直接塗片革蘭染色鏡檢的結果不可靠，假陽性及假陰性較高，故塗片檢查只用於初步判斷，不作爲確診依據。
4.3 杜克雷嗜血桿菌運送與分離培養
4.3.1 材料
4.3.1.1 運送培養基
BM-SGA運送培養基。主要成分包括：L-谷氨醯胺、小牛白蛋白V、3 mg/L萬古黴素。
4.3.1.2 分離培養基
1.改良Thayer-Martin培養基。主要成分包括：GC基礎培養基粉、血紅蛋白、1%IsoVitaleX增菌劑、3 mg/L萬古黴素。
2.巧克力瓊脂培養基。主要成分包括：肉浸液（肉膏液）瓊脂、無菌脫纖維血、3 mg/L萬古黴素（培養基製備參見附錄B）。
4.3.2 培養條件
將標本接種於培養基上，分區劃線分離。接種了標本的培養基應置於相對溼度80%以上，培養溫度33℃～35℃，5%～10%-氧化碳環境（燭缸）中培養。48 h～72 h觀看結果。未出現陽性結果的平皿應繼續觀察7d後才能丟棄。
4.3.3 培養菌落初步鑑定
菌落特徵：杜克雷嗜血桿菌經48 h～72 h培養後，可形成直徑1 mm～2 mm菌落，菌落光滑、呈半透明狀，淺灰色或黃灰色。陳1日性培養物，菌落扁平，顏色變成灰白到棕黃。用白金耳可以完整地將菌落沿瓊脂表面推動，即推動試驗陽性，爲杜克雷嗜血桿菌菌落的典型特徵。
革蘭染色：從菌落取材做塗片，革蘭染色鏡檢（見A．2）。
4.4 生化鑑定試驗
4.4.1 氧化酶試驗
原理：杜克雷嗜血桿菌酶系統不完善，但能產生弱氧化酶，它產生的氧離子能將氧化酶試劑（鹽酸二甲基對苯胺）氧化成醌類化合物，出現弱顏色反應。但也有報告氧化酶試驗陰性的菌株。
方法：將氧化酶試劑配製成0.5%～1.0%水溶液。將溶液滴加於可疑菌落上，觀察顏色變化。 A．
結果：在滴加1%鹽酸二甲基對苯胺溶液後，一般於15 s～20 s內菌落即呈淡紅色，然後逐步變成深紫藍色，最後呈黑色。
臨牀意義：氧化酶試驗、菌體形態和菌落形態是初步鑑定杜克雷嗜血桿菌的三個重要標準。
4.4.2 過氧化氫酶試驗
原理：具有觸酶（即過氧化氫酶）的細菌可催化過氧化氫放出初生態氧，繼而形成氧分子出現氣泡。
方法（玻片法）：挑取培養基上的菌落，置於乾淨的玻片上，然後加1滴3%～6%過氧化氫，立即觀察結果。
結果：於30 s內有氣泡產生者爲陽性。
4.4.3 卟啉試驗
原理：用於檢測細菌將鹽酸δ-氨基-γ-酮戊酸轉變成卟啉及卟吩膽色素原的能力。因爲杜克雷嗜血桿菌是嚴格依賴氯化血紅素生長的一種嗜血桿菌，它沒有將鹽酸δ-氨基-γ-酮戊酸轉變成卟啉的能力，試驗結果爲陰性反應。
方法：在12 mm×75 mm的試管中加入0.5 mL的2 mmol/L鹽酸-δ-氨基乙酰丙酸溶液中製備濃菌懸液（1×109/mL），將試管放在35℃～37℃孵箱中4h。再將試管於暗室中用wood燈照射，觀察結果。
臨牀意義：嚴格依賴氯化血紅素的杜克雷嗜血桿菌缺乏轉變成卟啉能力，因而呈陰性。
4.4.4 硝酸鹽還原試驗
1） 細菌在合成代謝過程中，將硝酸鹽還原爲亞硝酸鹽和氮，再由氨轉化成氨基酸和細菌內其他 含氮化合物。
2） 在分解代謝過程中，硝酸鹽或亞硝酸鹽替代氧作爲呼吸系統中的終末受氫體。硝酸鹽的還原 過程因細菌而異，杜克雷嗜血桿菌能還原培養基中的硝酸鹽爲亞硝酸鹽，亞硝酸鹽與試劑中的醋酸作用，生成亞硝酸，亞硝酸與試劑中的氨基苯磺酸作用生成重氮苯磺酸，再與試劑中的α-萘胺結合而成爲N-α-萘胺偶氮苯磺酸（紅色）。
方法：取48 h的培養物製成濃菌懸液（109/mL），取0.04 mL於小試管中，加入0.04 mL 0.05% NaNO3溶液和0.04 mL的25 mmol/L磷酸緩衝液（pH 6.8）。在35℃水浴孵育1 h。分別加入0.5%對氨基苯磺酸乙酸溶液和0.5%萘胺乙酸溶液各0.06 mL，搖勻，觀察。
結果：2 min～10 min內顯色，出現粉紅色爲陽性，不出現粉紅色爲陰性。
4.4.5 鹼性磷酸酶試驗
方法：在含0.5 mL 0.03%無酚磷酸二鈉試管中製備濃菌懸液（109/mL）。將試管置37℃水浴孵育4h，加4滴0.5%2,6-二溴醌-4-氯亞胺甲醇溶液，搖勻，置室溫15 min。加入0.3 mL n-丁醇，搖勻靜置5 min。觀察。
結果：在丁醇層出現藍紫色爲陽性。
4.4.6 杜克雷嗜血桿菌生化試驗鑑定結果
嗜血桿菌氧化酶試驗陽性，過氧化氫酶試驗陰性，卟啉試驗陰性，硝酸鹽還原試驗陽性，鹼性磷酸酶試驗陽性。
4.4.7 培養意義及注意事項
杜克雷嗜血桿菌培養法的敏感性爲60%～80%，是目前世界衛生組織推薦和診斷軟下疳病人的主要實驗室方法。杜克雷嗜血桿菌對環境的抵抗力很弱，爲提高培養的成功率，標本的離體時間越短越好，取材後應立即接種於分離培養基。對不能及時接種到分離培養基的臨牀標本，應置於運送培養基，但必須在一週內轉種到分離培養基上。
4.5 運送和分離杜克雷嗜血桿菌培養基的製備
4.5.1 運送培養基BM-SGA製備
4.5.1.1 BM成分
BM成分如下：
b） 硝酸鎂（magnesium nitrate） 0.1 g；
c） 磷酸二氫鉀（KH2PO4）2.0 g；
d） 氯化鈉（sodium chloride） 5.0 g；
e） 氯化鈣（Calcium Chloride） 0.1 g；
f） 血紅素0.2 g；
g） 巰基乙酸鈉（sodium thiglycollate） 1.0 g；
h） Bacto瓊脂7.5 g；
i） 蒸餾水990 mL;
j） 調pH至7.5。
4.5.1.2 SGA成分
SGA成分如下：
a） 二氧化硒（SeO2） 0.003 mg/L;
b）L-谷氨醯胺（L-glutamine）3 mg/L;
c） 萬古黴素（vancomycin）3 mg/L;
e） 蒸餾水10 mL。
4.5.1.3 配製方法
SGA成分採用孔徑爲0.45μm濾膜過濾除菌備用。BM成分於121℃滅菌15 min，待冷至50℃，無菌操作加入SGA溶液混勻，分裝於帶螺旋蓋的無菌試管內，每管6 mL，放4℃可用30 d。
4.5.2 分離培養基製備
4.5.2.1 改良Thayer-Martin培養基製備
4.5.2.1.1 成分
GC基礎培養基粉
每3.6 g GC基礎培養基粉可配100 mL T-M成品培養基，其中含蛋白腖1.5 g、玉米粉0.1 g、磷酸氫二鉀（K2HPO4）0.4 g、磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.1 g、氯化鈉（NaCl）0.5 g和瓊脂1.2 g。
VCN抑菌劑
1 mL溶液中含萬古黴素（vancomycin） 300μg、粘菌素（colistin） 750μg和制黴菌素（nystatin）1250單位。爲抑制變形桿菌可加三甲氧苄氨嘧啶500μg。製成後立即用完或貯存-200C以下於2周內用完。
lsoVitaleX增菌劑
每1L蒸餾水中加入成分如下：
a） 維生素B12 （vitamin B12） 0.01 g；
b） L-谷氨醯胺（L-glutamine） 10.0 g；
c） P-氨基苯甲酸（P-aminobenzoic acid） 0.012 g；
d） 腺嘌呤（adenine）1.0 g；
e） 鳥嘌呤（guanine）0.03 g；
f） 二磷酸吡啶核苷酸（diphosphopyridine nucleotide osidized，coenzyme Ⅰ）0.25 g；
g） 輔羧酶（cocarboxylase）0.1 g；
h） 硝酸鐵（ferric nitrate）0.02 g；
i） 鹽酸硫胺（thiamine HCl） 0.003 g；
j） L-半胱氨酸（L-cysteine） 25.9 g；
k） L-胱氨酸（L-cystine）1.1 g；
1） 葡萄糖（dextrose） 100 g。
4.5.2.1.2 配製
以配500 mL T-M培養基爲例，具體配製如下：
a） 製取雙倍濃度的基礎培養基：將GC基礎粉18 g溶於235 mL蒸餾水中（用500 mL燒瓶），充分搖勻，邊加熱邊攪動，直至煮沸1 min，使之完全溶解。
b） 將5g血紅蛋白粉加到250 mL水中製成2%溶液。混合時，5g血紅蛋白先加水5 mL～10 mL，研成糊狀，再逐步加入蒸餾水，使整個溶液成勻漿狀。也可用2%血紅蛋白溶液成品。
c） 將上述二液分別以121℃高壓滅菌15 min後冷卻到500C左右備用。2%血紅蛋白溶液成品不必高壓，只需在臨用前稍加熱即可。
d） 配製增菌液：每安瓿增菌劑加入隨同附來的稀釋液10 mL，使溶解。
e） 配製抑菌劑：每安瓿抑菌劑用無菌操作加入蒸餾水5 mL，搖動，使充分溶解。
f） 用無菌操作將2%血紅蛋白溶液250 mL、增菌液10 mL、抑菌劑5 mL和GC培養基235 mL混合。
總體積爲500 mL，可倒70 mm平皿25個～30個。
4.5.2.2 巧克力瓊脂的配製
4.5.2.2.1 成分
肉浸液（或肉膏液）瓊脂（pH 7.2～7.4）1000 mL，無菌脫纖維血（羊血或兔血）80 mL～100 mL，萬古黴素3 mg/L（或多粘菌素B 25 U/mL）。
4.5.2.2.2 配製
將肉浸液瓊脂高壓滅菌，待涼至45℃時加入脫纖維血（血液在臨用前置於370C水浴預熱），搖勻後再置於水浴中，徐徐加熱到85℃～90℃作用5 min～10 min，再冷卻到50℃左右。爲抑制雜菌，在冷卻到45℃左右時加入萬古黴素3 mg/L（或多粘菌素B 25 U/mL），再輕輕搖勻後傾注於滅菌平皿中。
5 參考資料
- ^ [1] 中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會．WS/T 191—2017 軟下疳診斷[Z]．2017-7-24．