2 概述
蟬花（Isaria cicadaeMiq.）子實體（人工培植）爲新食品原料，又名蟬棒束孢子實體，在我國浙江、廣東、福建、四川等省民間具有食用歷史。蟬花子實體（人工培植）是將蟬花菌種接種到培養基上進行人工培養，經採收子座（即孢梗束）、乾燥等工藝製成，含有蛋白質、多糖等成分，其推薦食用量爲≤3克/天（以幹品計）。蟬花子實體（人工培植）在嬰幼兒、孕婦、哺乳期婦女、食用菌過敏者人羣中的食用安全性資料不足，從風險預防原則考慮，上述人羣不宜食用，標籤及介紹中應當標註不適宜人羣。
2020年12月28日國家衛生健康委發佈《關於蟬花子實體（人工培植）等15種“三新食品”的公告》，宣佈對蟬花子實體（人工培植）的安全性評估材料審查通過。
該原料食品安全指標按照我國現行食品安全國家標準中食用菌類的規定執行。此外，黃麴黴毒素B1、黃麴黴毒素B2、黃麴黴毒素G1、黃麴黴毒素G2、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、赭麴黴毒素A、玉米赤黴烯酮不得檢出；白僵菌素含量≤3 mg/kg。
6 推薦食用量
≤3 克/天（以幹品計）[1]
7 注意事項
1.嬰幼兒、孕婦、哺乳期婦女及食用菌過敏者不宜食用，標籤及介紹應當標註不適宜人羣。
2.食品安全指標按照我國現行食品安全國家標準中食用菌類的規定執行。黃麴黴毒素 B1、黃麴黴毒素 B2、黃麴黴毒素 G1、黃麴黴毒素 G2、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、赭麴黴毒素 A、玉米赤黴烯酮不得檢出；白僵菌素含量≤3 mg/kg。
8 蟬花子實體中白僵菌素的檢測方法
8.1 1 範圍
本方法規定了蟬花子實體原料中白僵菌素的檢測方法。適用於蟬花子實體中白僵菌素的檢測。
8.2 2 原理
試樣中的白僵菌素，用乙腈-水溶液提取，提取液經固相萃取柱淨化後，超高壓液相色譜-串聯質譜檢測，外標法定量。
8.3 3 試劑和材料
除非另有說明，本方法所用試劑均爲分析純，水爲 GB/T 6682 規定的一級水。
3.1 試劑
3.1.1 甲醇（CH4O）：色譜純。
3.1.2 乙腈（C2H3ON）：色譜純。
3.1.3 甲酸（CH3COOH)：色譜純。
3.2 試劑配製
3.2.1 乙腈-水溶液（85+15）：量取 150 mL 水加入到 850 mL 乙腈中，混勻。
3.2.2 乙腈-水溶液（10+90）：量取 900 mL 水加入到 100 mL 乙腈中，混勻。
3.2.3 乙腈-水溶液（50+50）：量取 500 mL 水加入到 500 mL 乙腈中，混勻。
3.2.4 乙腈-水溶液（90+10）：量取 100 mL 水加入到 900 mL 乙腈中，混勻。
3.2.5 0.2%甲酸-水溶液：準確量取 2 mL 甲酸加入到 1000 mL 水中，混勻。
3.3 標準品
白僵菌素（BEA，C45H57N3O9 ，CAS號：26048-05-5）：純度≥97%。
3.4 標準溶液配製
3.4.1 標準儲備溶液（1.00 mg/mL）：稱取 BEA 10 mg（精確至 0.01mg），用乙腈溶解並定容至 10 mL。將溶液轉移至試劑瓶中，在-20℃下密封保存，有效期一年。
3.4.2 標準工作溶液 1（60.0 µg/mL）：準確吸取 1.00 mg/mL BEA 標準儲備液 0.6 mL 於 10 mL 容量瓶中，加乙腈定容至刻度。在-20℃下密封保存，有效期半年。
3.4.3 標準工作溶液 2（6.00 µg/mL）：準確吸取 60.0 µg/mL 標準工作溶液 1 mL 於 10 mL 容量瓶中，加乙腈定容至刻度。在-20℃下密封保存，有效期半年。
8.4 4 儀器和設備
4.1 液相色譜-串聯質譜儀：帶電噴霧離子源。
4.2 電子天平：感應量 0.01 g 和 0.00001 g。
4.3 渦旋振盪器。
4.4 固相萃取裝置。
4.5 固相萃取柱：兼具親水基團（吡咯烷酮基團）和疏水基團（二乙烯基苯）吸附劑填料的固相萃取小柱，200 mg，3 mL，或相當者。
4.6 高速離心機
4.7 勻漿機
4.8 水相微孔濾膜：0.22 μm。
8.5 5 分析步驟
8.5.1 5.1 試樣提取
稱取2 g（準確至0.01 g）試樣於50 mL離心管（或均質袋）中，加入40.0 mL（V1）乙腈-水（85+15），高速混勻120 s，置於渦旋振盪器中180 rpm振盪提取30 min，室溫靜置15–20 min。移取10 mL上清液（V2）於50 mL離心管中，加入20 mL（V3）超純水進行稀釋，渦旋混勻後室溫靜置15–20 min，收集上清液於乾淨的容器中備用。
8.5.2 5.2 試樣淨化
取4 mL（V4）上清液全部通過事先用3 mL甲醇和3 mL超純水預先活化的SPE柱，再依次用3 mL 10%乙腈水溶液和3 mL 50%乙腈水溶液淋洗、負壓下抽乾SPE柱。最後用2 mL（V）90%乙腈水溶液洗脫，負壓下抽乾SPE柱並收集洗脫液，渦旋混勻，採用0.22 μm微孔濾膜過濾於進樣瓶中，待進樣。
8.5.3 5.3 液相色譜參考條件
色譜參考條件列出如下：
a) 色譜柱：C18柱（柱長 100 mm，柱內徑 2.1 mm，填料粒徑 1.7μm）；
c) 梯度洗脫：0–1 min，80%A；3 min，60% A；12 min，30%A；12.1–15.0 min，10% A；15.1–17.0 min，80% A；
d)流速：0.30 mL/min；
e) 柱溫：35℃；
f) 進樣體積：2 µL。
8.5.4 5.4 質譜參考條件
質譜參考條件列出如下:
b)掃描時間（Scan Time）：0.5 sec；
c) 離子源： Tube Spray；電離方式：ESI+；離子噴霧電壓：5500V；離子源溫度：550℃；
d)碰撞解離能量 CAD medium；
e) 氣體 1（Ion Source Gas 1） 55 psi；氣體 2（Ion Source Gas 2）55 psi；氣簾氣（Curtain Gas，CUR）35 psi；
f) 離子選擇參數：參見表 A.1；
表 A.1 離子選擇參數表
8.5.5 5.5 定性測定
目標化合物的定性以保留時間和兩對離子（特徵離子對/定量離子對）所對應的 LC-MS/MS 色譜峯相對丰度進行。試樣中目標化合物對應色譜峯的保留時間與相應標準色譜峯相比較，變化範圍應在±2.5%之內。
試樣中與標準溶液中目標化合物色譜峯丰度比，同一檢測批次樣品中目標化合物的兩對離子對應的 LC-MS/MS 色譜峯相對丰度比與濃度相當的標準溶液相比，其允許偏差不超過表 A.2 規定的範圍。
8.5.6 5.6 標準曲線的製作
準確稱取不含目標物的蟬花子實體乾粉 6 份，每份爲 2 g（精確至0.01 g），分別加入 6.00 µg/mL 標準工作溶液 5 μL、10 μL、50 μL、100μL、200 μL 和 500 μL，按照“5.1、5.2”的步驟操作，得濃度分別爲 0.5ng/mL、1.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL 的系列基質匹配標準溶液。
5.6.2 標準曲線
在 5.3、5.4 的液相色譜串聯質譜儀分析條件下，將基質匹配標準溶液由低到高濃度進樣檢測，外標法定量，以 BEA 色譜峯面積-濃度作圖，得到標準曲線迴歸方程，其線性相關係數應大於 0.99。
8.5.7 5.7 試樣溶液的測定
取 5.2 處理得到的待測溶液進樣，外標法計算待測液中目標物質的質量濃度，按第 6 章計算樣品中待測物的含量。待測樣液中的響應值應在標準曲線線性範圍內，超過線性範圍則應適當減少取樣量重新測定。
8.5.8 5.8 空白試驗
不稱取試樣，按 5.1 和 5.2 的步驟做空白實驗。應確認不含有干擾待測組分的物質。
8.6 6 分析結果的表述
試樣中 BEA 的含量按式（1）計算。
式中：
X——試樣中 BEA 的含量，單位爲微克每百克（µg/100g）；
ρ——試樣中 BEA 按照外標法在標準校正曲線中對應的質量濃度，單位爲納克每毫升（ng/mL）；
f——樣液稀釋因子；
m——試樣的稱樣量，單位爲克（g）；
1000——換算係數。
計算結果保留三位有效數字。
8.7 7 精密度
在重複性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的 20%。
8.8 8 其他
當稱原料試樣 2.0 g 時，方法中的白僵菌素檢出限爲 0.5 μg/kg，定量限爲 1.5 μg/kg。
8.9 附錄 A.1 白僵菌素標準物質多反應監測（MRM）色譜圖
圖 A.1 5μg/L 白僵菌素標準物質多反應監測（MRM）色譜圖
1.白僵菌素定量離子色譜圖（801.4>244.1）
9 參考資料
- ^ [1] 國家衛生健康委．關於蟬花子實體（人工培植）等15種“三新食品”的公告[Z]．2020-12-28．