WS/T 683—2020 消毒試驗用微生物要求

中華人民共和國衛生行業標準

目錄

心氣虛,則脈細;肺氣虛,則皮寒;肝氣虛,則氣少;腎氣虛,則泄利前後;脾氣虛,則飲食不入。
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1 拼音

WS/T 683—2020 xiāo dú shì yàn yòng wēi shēng wù yào qiú

2 英文參考

Requirements of microorganism for disinfection test

3 基本信息

ICS 11.080

C 50

中華人民共和國衛生行業標準 WS/T 683—2020 《消毒試驗用微生物要求》(Requirements of microorganism for disinfection test)由中華人民共和國國家衛生健康委員會於2020年07月20日《關於發佈<消毒試驗用微生物要求>等4項推薦性衛生行業標準的通告》(國衛通2020年14號)發佈 ,自2021年02月01日起實施。

4 發佈通知

關於發佈《消毒試驗用微生物要求》等4項推薦性衛生行業標準的通告

國衛通2020年14號

現發佈《消毒試驗用微生物要求》等4項推薦性衛生行業標準,編號和名稱如下:

WS/T 683—2020  消毒試驗用微生物要求

WS/T 684—2020  消毒劑與抗抑菌劑抗菌藥物檢測方法與評價要求

WS/T 685—2020  消毒劑與抗抑菌劑抗真菌藥物檢測方法與評價要求

WS/T 686—2020  消毒劑與抗抑菌劑抗病毒藥檢測方法與評價要求

上述標準自2021年2月1日起施行。

特此通告。

國家衛生健康委

2020年7月20日

5 前言

本標準按照 GB/T 1.1—2009 給出的規則起草。

本標準起草單位:中國疾病預防控制中心環境與健康相關產品安全所、江蘇省疾病預防控制中心、中國人民解放軍疾病預防控制中心、北京市疾病預防控制中心、山東省疾病預防控制中心、黑龍江省疾病預防控制中心、廣州海關技術中心。

本標準主要起草人:沈瑾、段弘揚、王林、張流波、徐燕、魏秋華、王佳奇、佟穎、崔樹玉、李濤、李炎、林玲、吳曉松、於禮、孫惠惠、廖如燕、楊彬、韓傑、李俐、朱亭亭。

6 標準全文

消毒試驗用微生物要求

6.1 1 範圍

本標準規定消毒試驗微生物培養基傳代保存、菌懸液和染菌載體製備的要求。

本標準所指消毒試驗用微生物僅包括細菌真菌、分枝桿菌細菌芽胞,不涉及消毒試驗用病毒及其他微生物的替代物(如酶、抗原核酸等)。

本標準適用於各種消毒試驗用微生物(除病毒和替代物外)的使用和保存

6.2 2 規範性引用文件

下列文件對於本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,僅注日期的版本適用於本文件。

凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用於本文件。

GB 18281.5 醫療保健產品滅菌 生物指示物 第5部分:低溫蒸汽甲醛滅菌生物指示物

GB/T 33417 過氧化氫氣體滅菌生物指示物檢驗方法

GB/T 33419 環氧乙烷滅菌生物指示物檢驗方法

GB/T 33420 壓力蒸汽滅菌生物指示物檢驗方法

消毒技術規範(2002年版) 衛生部 (衛法監發〔2002〕282號)

6.3 3 試驗微生物

6.3.1 3.1 來源

試驗微生物來源於具有資質的菌種保藏機構,並能通過常規檢測方法進行鑑定

6.3.2 3.2 細菌

6.3.2.1 3.2.1 金黃色葡萄球菌

消毒試驗以金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)作爲細菌繁殖體中化膿性球菌的代表,試驗

常用菌種爲ATCC 6538;消毒劑皮膚消毒模擬現場試驗時,用ATCC 27217。

6.3.2.2 3.2.2 大腸桿菌

消毒試驗以大腸桿菌(Escherichia coli)作爲細菌繁殖體中腸道菌的代表,試驗常用菌種爲8099;

消毒劑手消毒模擬現場試驗時,用8099或NCTC 10538。

6.3.2.3 3.2.3 銅綠假單胞菌

消毒試驗以銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)作爲醫院感染中最常分離細菌繁殖體的代

表,試驗菌種爲ATCC 15442。

6.3.2.4 3.2.4 白色葡萄球菌

消毒試驗以白色葡萄球菌(Staphylococcus albus)作爲空氣中細菌的代表,試驗菌種爲8032。

6.3.3 3.3 真菌

6.3.3.1 3.3.1 白色念珠菌

消毒試驗以白色念珠菌(Candida albicans)作爲致病性真菌的代表,試驗常用菌種爲ATCC 10231。

6.3.3.2 3.3.2 黑曲黴菌

消毒試驗以黑曲黴菌(Aspergillus niger)作爲致病性真菌的代表,試驗常用菌種爲ATCC 16404。

6.3.4 3.4 分枝桿菌

消毒試驗以龜分枝桿菌膿腫亞種(Mycobacterium chelonae subsp. abscessus)、鳥分枝桿菌(Mycobacterium avium subsp. avium)或地分枝桿菌(Mycobacterium terrae)作爲人結核分枝桿菌的代表,試驗用菌種龜分枝桿菌膿腫亞種CMCC(B)93326或ATCC 19977,鳥分枝桿菌ATCC 15769,地分枝桿菌ATCC 15755。

6.3.5 3.5 細菌芽胞

6.3.5.1 3.5.1 枯草桿菌黑色變種芽胞

消毒試驗以枯草桿菌黑色變種芽胞(Bacillus subtilis var.niger)作爲細菌芽胞的代表,試驗常用菌種爲ATCC 9372;用於指示乾熱滅菌效果時,符合《消毒技術規範》(2002年版)的要求;用於指示環氧乙烷滅菌效果時,符合GB/T 33419的要求。

6.3.5.2 3.5.2 嗜熱脂肪桿菌芽胞

嗜熱脂肪桿菌芽胞(Geobacillus stearothermophilus)是滅菌效果指示菌,菌種爲ATCC 7953或SSI K31;用於指示壓力蒸汽滅菌效果時,符合GB/T 33420的要求;用於指示過氧化氫氣體滅菌效果時,符合GB/T 33417的要求;用於指示低溫蒸汽甲醛滅菌效果時,符合GB 18281.5的要求。

6.3.5.3 3.5.3 短小桿菌芽胞

短小桿菌芽胞(Bacillus pumilus)是電離輻射滅菌消毒的指示菌,菌種爲E 601或ATCC 27142,符合《消毒技術規範》(2002年版)的要求。

6.3.6 3.6 其他

可根據消毒試驗要求,選擇抗力相當的其他菌種進行試驗。

6.4 4 培養基

4.1 選擇相應培養基和試劑進行菌種傳代和培養,消毒試驗所需培養基和試劑見附錄 A。

4.2 實驗室自行製備的固體斜面培養基和平板冷藏保存保存期不超過 3 個月,如出現缺水、乾裂等情況,滅菌處理後銷燬。實驗室自行製備的液體培養基密封冷藏保存保存期不超過 3 個月,如出現渾濁,滅菌處理後銷燬。

4.3 商品化平板、斜面和培養基產品介紹儲存並在有效期內使用。

6.5 5 傳代保存

6.5.1 5.1 復甦與傳代

5.1.1 以無菌操作方式開啓凍幹菌種管,加入適量培養液(按菌種選擇培養液,如細菌選擇營養肉湯、白色念珠菌選擇沙堡液體培養基、分枝桿菌選擇蘇通綜合液體培養基、黑曲黴菌選擇麥芽浸膏營養肉湯培養基),吹吸數次,使菌種融化分散。取含 5.0 mL~10.0 mL 相應培養液的試管,滴入少許菌種懸液,在適宜溫度下培養至規定時間(一般爲 36 ℃±1 ℃ 培養 18 h~24 h、黑曲黴菌爲 30 ℃± 1℃ 培養 42 h~48 h),此爲第 1 代培養物。

5.1.2 用接種環取第 1 代培養物,或從菌種凍存管中取適量菌液/瓷珠,劃線接種於相應培養基平板(按菌種選擇培養基,如細菌選擇營養瓊脂培養基、白色念珠菌選擇沙堡瓊脂培養基、分枝桿菌選擇改良羅氏培養基或其他商品化分枝桿菌專用複合瓊脂培養基、黑曲黴菌選擇麥芽浸膏瓊脂培養基),在適宜溫度下培養至規定時間(一般爲 36 ℃±1 ℃培養 18 h~24 h、分枝桿菌 36 ℃± 1℃培養 72 h、黑曲黴菌 30 ℃±1 ℃ 培養 42 h~48 h),此爲第 2 代培養物。

5.1.3 挑取第 2 代培養物中典型菌落,接種於相應培養基斜面或平板(按菌種選擇培養基斜面,如細菌選擇營養瓊脂斜面、白色念珠菌選擇沙堡瓊脂斜面、分枝桿菌選擇改良羅氏培養基或其他商品化分枝桿菌專用複合瓊脂斜面、黑曲黴菌選擇麥芽浸膏瓊脂培養基平板),在適宜溫度下培養至規定時間(一般爲 36 ℃±1 ℃培養 18 h~24 h、分枝桿菌 36 ℃±1 ℃培養 72 h、黑曲黴菌 30 ℃±1 ℃培養 42 h~48 h),此爲第 3 代培養物。

5.1.4 取第 3 代培養物,接種於相應培養基斜面,在適宜溫度下培養至規定時間,此爲第 4 代培養物。

5.1.5 按上述方法培養至所需代數,傳代時在試管上註明菌種名稱、菌種號、代數及傳代日期等基本信息

6.5.2 5.2 保存

6.5.2.1 5.2.1 菌種斜面的保存

5.2.1.1 傳代菌種採用斜面冷藏保存

5.2.1.2 將菌種接種在適宜的固體斜面培養基上,在適宜溫度下培養至規定時間,生長充分後,轉移至冰箱冷藏保存,以備實驗傳代用。此法用於實驗用菌種短期保存,隨時檢查污染雜菌和變異等情況,發現異常,滅菌處理後銷燬。

5.2.1.3 保存時間與菌種類型有關,一般存儲時間不超過 9 周,銅綠假單胞菌和分枝桿菌不超過 6 周,如保存期內,斜面出現缺水、乾裂等情況,滅菌處理後銷燬。

6.5.2.2 5.2.2 菌種凍存管的保存

菌種可採用甘油液體石蠟、瓷珠等方式凍存,根據其特性選擇適宜凍存方法,常用方法參見附錄B。凍存管註明菌種名稱、菌種號、凍存日期等基本信息菌種凍存管在-80 ℃保存不宜超過18個月。可間隔一段時間,將菌種凍存管復甦後,重新凍存。

6.5.2.3 5.2.3 真空冷凍乾燥保存

採用真空冷凍技術,將菌種冷凍乾燥成菌粉後長期保存菌種管註明菌種名稱、菌種號、日期等基本信息,-20 ℃±2 ℃冷凍保藏

6.6 6 菌懸液的製備

6.6.1 6.1 細菌繁殖體懸液的製備

6.1.1 取第3代~第8代的營養瓊脂培養基培養18 h~24 h的新鮮斜面培養物,用5.0 mL吸管吸取 3.0mL~5.0 mL 稀釋液(除酸性電解水用生理鹽水外,其他均用胰蛋白腖生理鹽水溶液)加入斜面試管內,反覆吹吸,洗下菌苔。用 5.0 mL 吸管將洗脫液移至另一無菌試管中,用電動混勻器混合 20 s,或在手掌上振打 80 次,使細菌懸浮均勻。

6.1.2 將製成的菌懸液,進行活菌培養計數,按其結果用稀釋液稀釋至所需濃度,懸液定量殺滅試驗時,菌懸液濃度爲 1×108CFU/mL~5×108CFU/mL。

6.1.3 細菌繁殖體懸液冷藏保存備用,當天使用。

6.1.4 懷疑有污染時,以菌落形態、革蘭染色與生化試驗等方法進行鑑定

6.6.2 6.2 枯草桿菌黑色變種芽胞懸液的製備

6.2.1 以無菌操作方式開啓菌種管,加入適量營養肉湯培養基,吹吸數次,使菌種融化分散。取含 5.0mL~10.0 mL 營養肉湯培養基試管,滴入少許菌種懸液,置 36 ℃±1 ℃培養 18 h~24 h。用接種環取第 1 代培養的菌懸液,劃線接種於營養瓊脂培養基平板上,置 36 ℃±1 ℃培養 18 h~24 h。挑取上述第 2 代培養物中典型菌落,接種於營養肉湯培養基,置 36 ℃±1 ℃培養 18 h~24 h,即爲第 3 代培養物。

6.2.2 用 10.0 mL 吸管吸取 5.0 mL~10.0 mL 第 3 代~5 代的 18 h~24 h 營養肉湯培養物,接種於羅氏瓶(或細胞培養瓶)營養瓊脂培養基表面,將其搖動使菌液佈滿培養基表面,將多餘肉湯培養物吸出,羅氏瓶(或細胞培養瓶)置 36 ℃±1 ℃ 恆溫培養箱內培養 5 d~7 d。

6.2.3 用接種環取少許菌苔塗於玻片上,以改良芽胞染色法染色。改良芽胞染色法:用接種環取菌苔塗於玻片上,自然乾燥後,通過火焰加熱將菌固定於玻片上;將塗片放入平皿內,片上放兩層濾紙,滴加足量的 5.0%孔雀綠水溶液,將平皿蓋好,置 55 ℃±1 ℃加熱 30 min。取出,去濾紙,用自來水衝去殘留液;加 0.5%沙黃水溶液,1 min 後水洗,待幹後鏡檢。芽胞呈綠色,菌體呈紅色。在顯微鏡(油鏡)下鏡檢,當芽胞形成率達 90%以上時,即可進行以下處理。否則,繼續在室溫下放置一定時間,直至達到上述芽胞形成率後再進行以下處理。

6.2.4 加 10.0 mL 無菌蒸餾水於羅氏瓶(或細胞培養瓶)中,以 L 棒輕輕刮下菌苔,吸出,再加入 5.0mL 無菌蒸餾水沖洗培養基表面,吸出。將兩次吸出的菌懸液集中於含玻璃珠的無菌錐形燒瓶中,振搖 5min。

6.2.5 將燒瓶置 45 ℃水浴 24 h,使菌自溶斷鏈,分散成單個芽胞

6.2.6 用無菌棉花或紗布過濾芽胞懸液,清除瓊脂凝塊。

6.2.7 將芽胞懸液置無菌離心管內,以 3000 r/min 速度離心 30 min。棄上清液,加蒸餾水吹吸使芽胞重新懸浮。再離心和重新懸浮清洗,本步驟重複進行 3 遍。

6.2.8 將洗淨的芽胞懸液放入含適量小玻璃珠的燒瓶內,80 ℃水浴 10 min(或 60 ℃水浴 30 min),以殺滅殘餘的細菌繁殖體。待冷至室溫後,搖勻分裝後冷藏保存備用,有效使用期 6 個月。

6.2.9 芽胞懸液在使用時,先進行活菌培養計數。

6.2.10 懷疑有污染時,以菌落形態、革蘭染色與生化試驗等方法進行鑑定

6.6.3 6.3 真菌懸液製備

6.3.1 白色念珠菌懸液的製備

6.3.1.1 取第 3 代~第 6 代的沙堡瓊脂培養基斜面新鮮培養物(18 h~24 h),用 5.0 mL 吸管吸取 3.0mL~5.0 mL 稀釋液加入斜面試管內,反覆吹吸,洗下菌苔。用 5.0 mL 吸管將洗脫液移至另一無菌試管中,用電動混勻器混合 20 s,或者在手掌上振打 80 次,使白色念珠菌懸浮均勻。

6.3.1.2 將製成的菌懸液,進行活菌培養計數,按其結果用稀釋液稀釋至所需濃度,懸液定量殺滅試驗時,菌懸液濃度爲 1×107CFU/mL~5×107CFU/mL。

6.3.1.3 菌懸液冷藏保存,當天使用。

6.3.1.4 懷疑有污染時,以菌落形態、革蘭染色與生化試驗等方法進行鑑定

6.3.2 黑曲黴菌孢子懸液的製備

6.3.2.1 挑取第 2 代培養物中典型菌落,接種於麥芽浸膏營養肉湯培養基中,置 30 ℃±1 ℃恆溫培養箱中培養 42 h~48 h,即爲第 3 代培養物。

6.3.2.2 用 10.0 mL 吸管吸取 5.0 mL~10.0 mL 第 3 代培養物,接種羅氏瓶,並搖動使菌液佈滿麥芽浸膏瓊脂培養基表面,將多餘肉湯培養物液體吸出,置 30 ℃± 1℃恆溫培養箱中培養 42 h~48 h。

6.3.2.3 向羅氏瓶培養物中加入 5.0 mL~10.0 mL 0.05%(V/V)吐溫 80 生理鹽水溶液,刮洗黑曲黴菌分生孢子溶液中,將孢子懸液移入裝有玻璃珠的三角瓶中,輕輕振搖 1 min,過濾除去菌絲後,顯微鏡下(400 倍)觀察是否仍有菌絲存在,若有可經 5000 r/min~6000 r/min 離心 20 min。再次在顯微鏡下(400 倍)觀察,必要時重複上述步驟。

6.3.2.4 黑曲黴菌分生孢子懸液冷藏保存不超過 2 d,使用前,混合均勻,在顯微鏡下(400 倍)觀察是否有孢子出芽,若有則不得使用。

6.3.2.5 將製成的菌懸液,進行活菌培養計數,按其結果用稀釋液稀釋至所需濃度,懸液定量殺滅試驗時,菌懸液濃度爲 1×107CFU/mL~5×107CFU/mL。

6.6.4 6.4 分枝桿菌懸液製備

6.4.1 取第 3 代斜面培養物,在改良羅氏培養基或其他商品化分枝桿菌專用複合瓊脂培養基斜面上連續傳代,培養方法與第 3 代相同,取第 5 代~第 6 代的 72 h 新鮮培養物,用 5.0mL 吸管吸取 3.0 mL~5.0 mL 稀釋液加入斜面試管內,反覆吹吸,洗下菌苔。用 5.0 mL 吸管將洗脫液移至含有 6 g~7 g 玻璃珠的無菌圓錐底試管中,用電動混勻器混合至少 5 min。將菌液吸入至另一試管內,製成菌懸液,冷藏保存,當天使用。

6.4.2 將製成的菌懸液,進行活菌培養計數,按其結果用稀釋液稀釋至所需濃度,懸液定量殺滅試驗時,菌懸液濃度爲 1×107CFU/mL~5×107CFU/mL。

6.7 7 染菌載體的製備

7.1 載體根據消毒對象選擇相應的材料,如手術器械選擇不鏽鋼片,物體表面選擇棉布片,非金屬管腔選擇聚四氟乙烯片(管),光滑表面可選擇玻璃片等。常用的材料有金屬玻璃、濾紙、棉布、聚四氟乙烯等,金屬載體一般用 12 mm 直徑圓形金屬片(厚 0.5 mm),其他材質載體一般爲方形,大小 10mm×10 mm,特殊試驗可使用其他材質、形狀載體。評價氣體、霧化等消毒方式時,不可使用布片和濾紙片等有吸附能力載體

7.2 所用載體(除濾紙片外)於染菌前,進行脫脂處理。脫脂方法如下:a)將載體放在含鹼性洗滌劑的水中煮沸 30 min;b)以自來水洗淨;c)用蒸餾水煮沸 10 min;d)用蒸餾水漂洗至 pH 呈中性;e)晾乾、熨平備用。

7.3 布片用 40 織紗的白平紋棉布製作。將脫脂後的布塊按載體規定大小抽去邊緣一週的經緯紗各一根,按抽紗痕剪開。金屬片以不鏽鋼製作,紙片以濾紙製作。

7.4 載體經壓力蒸汽滅菌後,使用滴染法染菌。

7.5 染菌用菌懸液:菌懸液和芽胞懸液的製備按第 6 章進行,然後加入等量 3.0%或 0.3%的牛血白蛋白

7.6 滴染法染菌時,將經滅菌載體平鋪於無菌平皿內,用移液器逐個滴加菌液,必要時用接種環塗勻整個載體表面。置 36 ℃±1 ℃恆溫培養箱或者室溫乾燥備用,黑曲黴菌染菌載體置於二級生物安全櫃乾燥備用。

7.7 每個染菌載體的回收菌量爲 1×106CFU/個~5×106CFU/個。特殊染菌載體(如壓力蒸汽滅菌生物指示物)的回收菌量符合相應標準的要求。

7.8 染菌載體冷藏保存芽胞載體有效期 1 個月,其他染菌載體當天使用。

7 附錄

7.1 附錄A(規範性附錄)培養基和試劑

7.1.1 A.1 稀釋液

A.1.1 胰蛋白腖生理鹽水溶液(TPS)

胰蛋白腖 1.0 g

氯化鈉 8.5 g

蒸餾水 1000 mL

製成溶液,調pH至6.8~7.2(20 ℃),於121 ℃壓力蒸汽滅菌20 min備用。

A.1.2 生理鹽水

氯化鈉 8.5 g

蒸餾水 1000 mL

製成溶液,於121 ℃壓力蒸汽滅菌20 min備用。

7.1.2 A.2 孔雀綠與沙黃芽胞染色液

5.0%孔雀綠水溶液

0.5%沙黃水溶液

7.1.3 A.3 有機干擾物

牛血白蛋白 30.0 g 或 3.0 g

蒸餾水 1000 mL

溶解後用微孔濾膜(孔徑爲 0.45 μm)濾過除菌,冰箱冷藏保存備用。

7.1.4 A.4 營養瓊脂培養基

蛋白腖 10.0 g

牛肉膏 5.0 g

氯化鈉 5.0 g

瓊脂 15.0 g

蒸餾水 1000 mL

製成溶液,調pH至 7.2~7.4,於 121 ℃壓力蒸汽滅菌 20 min備用。

7.1.5 A.5 營養肉湯培養基

蛋白腖 10.0 g

牛肉膏 5.0 g

氯化鈉 5.0 g

蒸餾水 1000 mL

製成溶液,調 pH 至 7.2~7.4,於 121 ℃壓力蒸汽滅菌 20 min 備用。

7.1.6 A.6 胰蛋白腖大豆瓊脂培養基(TSA)

胰蛋白腖 15.0 g

大豆蛋白腖 5.0 g

氯化鈉 5.0 g

瓊脂 16.0 g

蒸餾水 1000 mL

製成溶液,調pH至7.2~7.4,於121 ℃壓力蒸汽滅菌20 min備用。

7.1.7 A.7 沙堡瓊脂培養基

葡萄糖 40.0 g

蛋白腖 10.0 g

瓊脂 20.0 g

蒸餾水 1000 mL

製成溶液,調 pH 至 5.4~5.8,於 115 ℃壓力蒸汽滅菌 30 min 備用。

7.1.8 A.8 沙堡液體培養基

葡萄糖 40.0 g

蛋白腖 10.0 g

蒸餾水 1000 mL

製成溶液,調 pH 至 5.4~5.8,於 115 ℃壓力蒸汽滅菌 30 min 備用。

7.1.9 A.9 蘇通綜合液體培養基

磷酸二氫鉀 0.50 g

硫酸鎂(MgSO4.7H2O) 0.50 g

檸檬酸鐵銨 0.05 g

檸檬酸 2.0 g

甘油 60 mL

天冬素 4.0 g

蒸餾水 940 mL

加熱溶解後,調pH至7.2~7.4,過濾、分裝,於121 ℃壓力蒸汽滅菌30 min備用。

7.1.10 A.10 改良羅氏培養基

味精穀氨酸鈉 95%以上) 7.20 g

磷酸二氫鉀 2.40 g

硫酸鎂 0.24 g

檸檬酸鎂 0.60 g

甘油 12 mL

馬鈴薯澱粉 30.0 g

2%孔雀綠 20 mL

全卵液 1000 mL

蒸餾水 600 mL

各鹽類成分溶解後,加馬鈴薯澱粉,混勻,沸水鍋內煮沸30 min~40 min(其間不時搖動,防凝塊),呈糊狀,冷卻後,加入經消毒紗布過濾的新鮮全卵液1000 mL,混勻。加2%孔雀綠20 mL,混勻,分裝試管,每一試管加培養基7 mL,培養基斜面高度爲培養基佔試管底部的2/3處爲宜;若製作培養基平板,則每皿加約30 mL~35 mL,置血清凝固器內凝固。

凝固器內溫度至90 ℃後,放入分裝好的培養基試管或平皿,以擺放兩層爲宜。待凝固器內溫度達85 ℃~90 ℃,計時,凝固1 h~1.5 h後取出,冷卻。無菌試驗後放冰箱冷藏備用,一個月內使用。

7.1.11 A.11 麥芽浸膏瓊脂培養基(MEA)

麥芽浸膏 30.0 g

大豆蛋白腖 3.0 g

瓊脂 15.0 g

蒸餾水 1000 mL

製成溶液,121 ℃ 20 min 壓力蒸汽滅菌滅菌無菌調節 pH 至 5.4~5.8 備用。

7.1.12 A.12 麥芽浸膏肉湯培養基(MEB)

麥芽浸膏 20.0 g

蒸餾水 1000mL

製成溶液,121 ℃ 20 min壓力蒸汽滅菌滅菌無菌調節pH至6.7~7.1備用。

7.2 附錄B(資料性附錄)菌種凍存方法

7.2.1 B.1 甘油冷凍管保存

無菌接種環刮取平板或瓊脂斜面的培養物,放入裝有無菌純化水的試管中,通過接種環與試管壁間的摩擦,使細菌充分擴散純化水中,製備成菌懸液。向已製備好的菌懸液中加入等體積的無菌甘油(濃度20%),即爲10%甘油菌懸液,輕輕振搖,充分混合後,分裝於無菌小試管或凍存管,冷凍保存

7.2.2 B.2 液體石蠟保存

B.2.1 無菌液體石蠟的製備

選用優質化學純液體石蠟,121 ℃ 30 min壓力蒸汽滅菌後,置40 ℃恆溫箱中蒸發水分,備用。

B.2.2 液體石蠟管的製備

菌種穿刺接種於半固體高層培養基中,在適宜條件下培養結束後,用無菌吸管吸取上述無菌液體石蠟至培養好的菌種管內,並使石蠟高出菌種表面約1 cm,使菌體與空氣隔絕,並將試管直立,置於-20 ℃冷凍或冷藏保存

7.2.3 B.3 真空冷凍乾燥

B.3.1 準備安瓿管

用於冷凍乾燥菌種保藏的安瓿管宜採用中性玻璃製造,可用長頸球形底安瓿管或管狀安瓿管,將安瓿管清洗乾淨,烘乾,管口塞好脫脂棉塞,121 ℃滅菌30 min,備用。

B.3.2 菌懸液的製備及分裝

無菌條件下,用2 mL~3 mL脫脂牛乳生長良好的純菌培養物從斜面上洗脫下來,製成菌懸液,分裝入安瓿管,每支安瓿管分裝0.1 mL~0.2 mL。

B.3.3 預凍

-80 ℃預凍1 h~2 h。

B.3.4 冷凍乾燥

將冷凍後的安瓿管置於冷凍乾燥機的乾燥箱內,開始冷凍乾燥,時間一般爲8 h~20 h。終止乾燥時間根據下列情況判斷:a)安瓿管內凍幹物呈酥塊狀或鬆散片狀;b)真空度接近空載時的最高值;c)選用1~2支對照管,其中加水與菌懸液同量,若對照管中水份已乾燥,視爲乾燥完結。

B.3.5 封口

真空乾燥後,取出安瓿管,接在封口用的玻璃管上,可用L形五通管繼續抽氣,約10 min即可達到26.7 Pa(0.2 mmHg)。於真空狀態下,以煤氣噴燈的細火焰在安瓿管頸中央進行封口。

B.3.6 保藏

安瓿管保存在-20 ℃冰箱。

B.4 瓷珠冷凍保存

按商品化菌種保存管介紹進行瓷珠冷凍保存

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