3 基本信息
ICS 11.020
C 59
中華人民共和國衛生行業標準 WS/T 562—2017《克-雅病診斷》（Diagnosis for Creutzfeldt-Jakob disease）由中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會2017年07月24日《關於發佈〈病原微生物實驗室生物安全通用準則〉等5項衛生行業標準的通告》（國衛通〔2017〕7號）發佈，自2018年02月01日起實施。
4 發佈通知
關於發佈《病原微生物實驗室生物安全通用準則》等5項衛生行業標準的通告
國衛通〔2017〕7號
現發佈《病原微生物實驗室生物安全通用準則》等5項衛生行業標準，其編號和名稱如下：
一、強制性衛生行業標準
WS 233—2017 病原微生物實驗室生物安全通用準則（代替WS 233—2002）；
WS 296—2017 麻疹診斷（代替WS 296—2008）。
二、推薦性衛生行業標準
WS/T 191—2017 軟下疳診斷（代替WS 191—1999）；
WS/T 236—2017 生殖器皰疹診斷（代替WS 236—2003）；
上述標準自2018年2月1日起施行，WS 233—2002、WS 296—2008、WS 191—1999、WS 236—2003同時廢止。
特此通告。
國家衛生計生委
2017年7月24日
5 前言
本標準按照GB/T1.1—2009給出的規則起草。
本標準起草單位：中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所、北京市友誼醫院、廣州市中山醫院、河南省疾病預防控制中心、北京市疾病預防控制中心。
本標準主要起草人：董小平、韓俊、陳操、石琦、王得新、高晨、田嬋、夏勝利、李洵樺、張秀春。
6 標準正文
克-雅病診斷
6.1 1 範圍
本標準規定了克-雅病和遺傳或家族型人類朊病毒病（包括遺傳或家族型克-雅病、吉斯特曼-施特勞斯綜合徵、致死性家族型失眠症）的診斷原則、診斷依據、診斷分類和鑑別診斷。
本標準適用於全國各級各類醫療衛生機構及其醫務人員對克一雅病和遺傳或家族型人類朊病毒病（包括遺傳或家族型克-雅病、吉斯特曼-施特勞斯綜合徵、致死性家族型失眠症）的診斷。
6.2 2 術語和定義
下列術語和定義適用於本文件。
2.1
克-雅病 Creutzfeldt-Jakob disease
德國科學家Creutzfeldt H.G.和Jakob A.M.在1922年首先報道的一種罕見的中樞神經系統疾病，後被證實爲人類的朊病毒病，包括散發型、遺傳或家族型、醫源型和變異型。其中散發型約佔病例總數的85%左右，遺傳或家族型約佔病例總數的10%～15%左右，醫源型約佔病例總數的1%左右。
2.2
朊病毒病 prion disease
一類由朊病毒引起的人類和動物中樞神經系統的可傳播性、退行性疾病。該病潛伏期長，病死率爲100%。朊病毒相關疾病、可傳播性海綿狀腦病也爲此類疾病的專有名詞。
2.3
朊病毒 prion
朊病毒病的感染因子，又稱羊瘙癢因子樣或澱粉樣朊蛋白（異常朊蛋白）（scrapie， amyloid-forming isoform of the prion protein，PrPSc）。目前認爲是一種不含核酸、具有自我複製能力的感染性蛋白粒子，由細胞表面的正常朊蛋白轉變而成的異常形式，具有感染性，可抵抗蛋白酶的水解作用（蛋白酶抗性），也有稱爲朊毒體、朊粒。
2.4
朊蛋白 prion protein
一種正常的細胞蛋白，又稱細胞型朊蛋白（cellular prion protein，PrPc），在中樞神經系統（腦和脊髓組織）的神經元細胞以及膠質細胞中表達，在機體其他組織包括外周組織、淋巴組織等細胞中也有表達。
2.5
散發型克-雅病 sporadic Creutzfeldt-Jakob disease
大多數克-雅病病例呈散發型，無地理上的聚集性，在病人之間無明顯傳播現象，由於至今沒有發現明確的發病原因，故稱爲散發型克一雅病。此類疾病的發病年齡在14歲～92歲之間，平均爲65歲。發病率爲1～2人／每百萬人／每年，男女病人的比例與整個人口的性別比例一致，與社會經濟狀況無關。
2.6
醫源型克-雅病 iatrogenic Creutzfeldt-Jakob disease
通過朊病毒污染的手術器械、角膜及硬腦膜移植或腦垂體提取物、生長激素及促性腺激素治療會感染受體患者，引起醫源型克-雅病。
2.7
遺傳或家族型人類朊病毒病 genetic or familial human prion disease
遺傳或家族型人類朊病毒病包括遺傳或家族型克-雅病、吉斯特曼-斯特勞斯綜合徵、致死性家族型失眠症。發病率約佔整個人類朊病毒病病例的10%～15%。
2.8
遺傳或家族型克-雅病 genetic or familialCreutzfeldt-Jakob disease
是一類遺傳或家族型人類朊病毒病，爲顯性特徵遺傳性疾病。當人類朊蛋白基因出現特定位點的點突變，以及出現特定的八肽重複插入或缺失時，引起此類疾病。此類患者的臨牀表現與散發型克一雅病相似，但依據突變位點和類型的不同，其發病年齡、臨牀病程、臨牀輔助檢查、實驗室檢測和病理變化有所差異。
2.9
吉斯特曼-施特勞斯綜合徵 Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome
此類患者的朊蛋白編碼基因出現特定的點突變及八肽插入，在臨牀表現和病理特徵上與遺傳或家族型克-雅病明顯不同，臨牀表現爲漸進性小腦共濟失調，神經病理上可見特徵性的澱粉樣斑塊沉積。
2.10
致死性家族型失眠症 fatal familial insomnia
當人類朊蛋白基因第129位密碼子爲甲硫氨酸純合子，第178位氨基酸由天冬氨酸（D）突變成天冬酰胺（N）時，此類患者出現嚴重的睡眠障礙。病理上表現爲顯著的丘腦神經元丟失和膠質增生，很少或幾乎沒有海綿狀變性。
2.11
變異型克-雅病 var iant Creutzfeldt-Jakob disease
1996年在英國首先發現的克-雅病新變種，多發生於年輕人，且其臨牀症狀和病理改變均與散發型克-雅病有所不同。此類病人的大腦和小腦出現廣泛的空泡樣變及“花瓣樣”的異常朊蛋白斑塊沉積。
已經證實變異型克-雅病與20世紀80年代中期在英國和歐洲暴發的牛海綿狀腦病相關。
6.3 3 縮略語
下列縮略語適用於本文件。
CJD:克-雅病（Creutzfeldt-Jakob disease）
FFI:致死性家族型失眠症（fatal familial insomnia）
fCJD:家族型克-雅病（familial CJD）
GSS:吉斯特曼-施特勞斯綜合徵（Gers tmann-Straus sler-Scheinker syndrome）
iCJD:醫源型克-雅病（iatrogenic CJD）
PRNP:朊蛋白基因（prion protein gene）
PrP:朊蛋白（prion protein）
PrPc：細胞型朊蛋白（正常朊蛋白）（cellular prion protein）
PrPSc：羊瘙癢因子樣或澱粉樣朊蛋白（異常朊蛋白） （scrapie，amyloid-forming isoform of theprion protein）
sCJD:散發型克-雅病（sporadic CJD）
TSE:可傳播性海綿狀腦病（transmissible spongiform encephalopathy）
vCJD:變異型克-雅病（variant CJD）
6.4 4 診斷原則
根據患者的流行病學史、臨牀症狀、臨牀輔助檢查、實驗室及基因學檢測綜合判斷。診斷結果分爲疑似診斷、臨牀診斷和確診診斷，其中病例的確診診斷依賴於在患者的腦組織中檢出具有蛋白酶抗性的 PrPSc和／或出現海綿狀變性和／或具有特定的PRNP基因突變。
6.5 5 診斷依據
6.5.1 5.1 散發型克-雅病
6.5.1.1 5.1.1 病史與流行病學史
病史與流行病學史如下：
b） 臨牀病程<2年；
c） 常規檢測排除其他疾病；
d） 無明確醫源性接觸史。
6.5.1.2 5.1.2 臨牀表現
臨牀表現如下：
a） 肌陣攣；
d） 無動性緘默。
6.5.1.3 5.1.3 臨牀檢查
特徵性的臨牀檢查結果如下：
b） 頭顱MRI成像可見殼核／尾狀核異常高信號，或者彌散加權像顯示對稱性灰質“緞帶（ribbon） 徵”。
6.5.1.4 5.1.4 實驗室檢測
特徵性的實驗室檢測結果如下：
b） 腦組織病理學檢測顯示具有典型／標準的神經病理學改變，即出現海綿狀變性（見附錄B）；
c） 腦組織免疫組織化學檢測存在蛋白酶抗性PrPSc的沉積（見附錄C）；
d） 腦組織Western印跡法檢測存在蛋白酶抗性PrPSc（見附錄D）。
6.5.1.5 5.1.5 診斷分類
診斷分類主要包括以下三種：
a） 疑似診斷：符合5.1.1加5.1.2任意兩條；
b） 臨牀診斷：在疑似診斷基礎上，符合5.1.3任意一條或5.1.4 a）；
c） 確診診斷：在疑似診斷基礎上，符合5.1.4中b）、c）、d）任意一條。
6.5.2 5.2 醫源型克-雅病
6.5.2.1 5.2.1 病史與主要臨牀表現
6.5.2.2 5.2.2 診斷分類
診斷分類僅爲確診診斷。
在散發型克-雅病確診診斷基礎上，符合以下任意一項：
a） 接受由人腦提取的垂體激素治療的病人出現進行性小腦綜合徵；
b） 確定的暴露危險，例如曾接受過來自CJD病人的硬腦膜移植、角膜移植等手術。
6.5.3 5.3 變異型克-雅病
6.5.3.1 5.3.1 病史與流行病學史
病史與流行病學史如下：
b） 病程≥6個月；
c） 常規檢查不提示存在有其他疾病；
d） 無明確醫源性接觸史；
e） 排除遺傳或家族型人類朊病毒病。
6.5.3.2 5.3.2 臨牀表現
臨牀表現如下：
c） 共濟失調；
d） 肌陣攣、舞蹈症、肌張力障礙；
e） 癡呆。
6.5.3.3 5.3.3 臨牀檢測
特徵性的臨牀檢測結果如下：
a） 早期腦電圖無典型的三相波（晚期可能出現三相波）；
b）MRI:彌散加權像、液體衰減反轉恢復成像顯示雙側丘腦枕（後結節）高信號。
6.5.3.4 5.3.4 實驗室檢測
特徵性的實驗室檢測結果如下：
a） 扁桃體Western印跡法檢測存在蛋白酶抗性PrPSc（見附錄E）或扁桃體免疫組織化學檢測證實具有PrPSc沉積（見附錄F）；
b） 腦組織病理學檢測顯示，大腦和小腦廣泛的空泡樣變（見附錄B）；
c） 腦組織免疫組織化學檢測證實具有“花瓣樣”的蛋白酶抗性PrPSc斑塊沉積（見附錄C）；
d） 腦組織Western印跡法檢測存在蛋白酶抗性PrPSc（見附錄D）。
6.5.3.5 5.3.5 診斷分類
診斷分類包括以下三種：
a） 疑似診斷：符合5.3.1加5.3.2中的任意4項加5.3.3a）；
b） 臨牀診斷：在疑似診斷的基礎上符合5.3.3 b）；或5.3.1加5.3.4 a）；
c） 確診診斷：在5.3.1加5.3.4中b）、c）、d）任意一條。
6.5.4 5.4 遺傳或家族型人類朊病毒病
6.5.4.1 5.4.1 病史與流行病學史
在一級親屬中存在遺傳或家族型人類朊病毒病確診病例。
6.5.4.2 5.4.2 診斷分類
診斷分類包括以下兩種：
a） 疑似診斷：在符合sCJD疑似診斷標準或出現進行性神經精神症狀的基礎上，加5.4.1。
b） 確診診斷：在疑似診斷的基礎上，病人PRNP基因序列檢測（見附錄G）證實具有特定的基因突變（參見附錄H）。
6.6 6 鑑別診斷
克-雅病的診斷應與病毒性腦炎、橋本腦病、線粒體腦病、阿爾茨海默病、血管性癡呆、中樞神經系統淋巴瘤及其他腦腫瘤、皮層靜脈血栓形成及副腫瘤性亞急性小腦變性相鑑別（參見附錄Ⅰ）。
7 附錄
7.1 附錄A（規範性附錄）腦脊液14-3-3蛋白Western blot檢測
7.1.1 A.1 原理
CJD病人腦脊液中14-3-3蛋白含量往往增高。腦脊液經SDS-PAGE電泳、電轉後，14-3-3蛋白與特異性抗體進行反應，顯色後出現30 KD左右的蛋白條帶。
7.1.2 A.2 實驗主要儀器
蛋白電泳和電轉裝置。
7.1.3 A.3 實驗步驟
按如下操作步驟進行：
b） 常規制備15%分離膠和5%濃縮膠，常規上樣，使用濃縮膠80 V，分離膠156 V的電壓條件下電泳2h。200 mA穩流70 min（溼式）或60 mA 60 min（半乾式）電轉移到硝酸纖維素膜。
c） 轉移完畢，膜用5%脫脂奶緩衝液（20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，0.15 mmol/L NaCl，0.05% Tween 20），1：1000稀釋一抗（一抗爲14-3-3蛋白特異性多克隆抗體），室溫振盪孵育2h或4℃孵育過夜。緩衝液洗3次，共30 min。
d） 與辣根過氧化物酶標記的抗兔IgG二抗（用緩衝液進行1：5000稀釋）37℃振盪孵育1 h。
緩衝液洗3次，共30 min。
e） ECL顯色。
7.1.4 A.4 結果判定
陽性對照採用羊腦組織勻漿液，或14-3-3陽性腦脊液；顯色後在30 KD位置出現一條蛋白條帶，與陽性對照中蛋白條帶泳動位置相同，即可判定爲腦脊液中14-3-3陽性。
7.2 附錄B（規範性附錄）腦組織病理學檢測
7.2.1 B.1 中樞神經組織分區採集
a） 除去硬腦膜，稱重。
b） 中樞神經組織經福爾馬林固定，固定最佳時間爲10 d～21 d。
c） 腦組織。常規途徑及方法切腦、分區取材，分別記錄、標記。
d） 脊髓。切開脊髓硬膜，分別記錄、標記頸、胸、腰部脊髓組織塊。然後採集脊神經根節。
e） 標本感染性的清除。在進一步檢測之前，所有的固定組織應在96%以上的甲酸溶液中浸泡至少1h。需要注意的是，由於變性劑相互作用可產生化學反應，任何事先經過酚處理的組織都不能再進行96%以上甲酸處理，故這些組織仍具有感染性。
7.2.2 B.2 標本脫水、浸蠟
70%乙醇 1 h 18℃～20℃
80%乙醇 1 h 18℃～20℃
90%乙醇 1 h 18℃～20℃ 重複兩次
無水乙醇 2h 18℃～20℃ 重複兩次
二甲苯 1 h 18℃～20℃ 重複兩次
浸蠟 1 h 58℃
浸蠟 1.5 h 58℃ 重複兩次
7.2.3 B.3 製片
製片主要包括以下四步：
b） 如果組織蠟塊未經96%甲酸處理，操作人員應戴金屬網狀手套防護以免損傷；
c） 用於常規病理檢測和免疫組織化學檢測的腦組織片厚度爲5μm；
d） 廢棄組織、蠟塊、碎片等收集後134 ℃高壓滅菌1 h或焚燒。
7.2.4 B.4 HE染色
7.2.5 B.5 結果判定
B.5.1 sCJD、gCJD或fCJD、iCJD
B.5.2 vCJD
丘腦後部大量星形膠質細胞增生，神經元丟失，即有大量的PrPSc沉積的海綿狀變性，特別是在大腦和小腦皮層灰質區在澱粉樣斑塊周圍圍繞着一圈海綿狀空泡（花瓣樣）。
B.5.3 GSS
很少或幾乎沒有海綿狀變性。
B.5.4 FFI
7.3 附錄C （規範性附錄）腦組織PrPSc的免疫組織化學檢測
7.3.1 C.1 原理
PrPSc具有抵抗變性劑、蛋白酶的水解作用，組織切片經高壓水解、變性劑或蛋白酶處理破壞PrPc後，以朊蛋白特異性抗體進行免疫組織化學染色，光學顯微鏡下觀測PrPSc蛋白沉積。
7.3.2 C.2 主要實驗儀器
7.3.3 C.3 實驗步驟
實驗操作按如下順序進行：
b） 取出後浸入水中5 min，飽和苦味酸浸泡15 min，除去福爾馬林色素；
c） 水洗3次，每次5 min，除去苦味酸；
d） 3%過氧化氫／甲醇封閉15 min～20 min（阻斷內源性過氧化物酶）；
e） 水洗3次，每次5 min;
f） 高壓水解（121℃，雙蒸水）10 min，或微波爐（高功率擋，雙蒸水）3次，每次5 min;
g） 取出後室溫冷卻；
h） 在含量不小於96%的甲酸中浸泡5 min～10 min（石蠟包埋前未作甲酸處理的標本）；
i） 水洗3次（緩慢水滴洗）；
j） 4 mol/L異硫氰酸胍浸泡2 h（4℃）；
k） 充分水洗；
1） 血清封閉1：100稀釋的正常羊血清／磷酸鹽緩衝液（PBS）封閉20 min;
m） 棄封閉液，加第一抗體（用1：100正常羊血清/PBS稀釋）孵育過夜，朊蛋白特異性單克隆抗體（如3F4），稀釋度爲1：500～1：1000;
n） PBS洗3次，每次5 min;
o） 加第二抗體（用1：100正常羊血清/PBS稀釋）孵育30 min，辣根過氧化物酶（HRP）標記的抗兔抗體1：200稀釋，用於多克隆抗體檢測；或HRP標記的抗小鼠抗體1：200稀釋，用於單克隆抗體檢測；
p） PBS洗3次，每次5 min;
r） 蘇木素（輕微）復染；
s） 常規脫水、透明、封片。
7.3.4 C.4 結果觀察
PrPSc蛋白陽性染色呈褐色，分佈可呈散在型、斑塊型和混合型，細胞核呈淡藍色。
7.3.5 C.5 結果判定
C.5.1 sCJD、iCJD、gCJD或fCJD
具有PrPSc的沉積（斑塊型、瀰漫性突觸型、斑塊／空泡周圍型）。
C.5.2 vCJD
在細胞周圍和血管周圍出現無明確形態的PrPSc斑塊，特別是在小腦。
C.5.3 GSS
C.5.4 FFI
很少或幾乎沒有PrPSc的沉積。
7.4 附錄D（規範性附錄）腦組織PrPSc的Western blot檢測
7.4.1 D.1 原理
PrPSc蛋白具有抵抗蛋白酶K水解且經蛋白酶K消化後分子量變小的特點。提取腦組織蛋白，經蛋白酶K水解後進行SDS-PAGE電泳。蛋白電泳條帶電轉至硝酸纖維素膜或尼龍膜，與PrP特異性單克隆抗體反應。具有蛋白酶抗性的蛋白條帶顯色後，位置在17 KD～27 KD。
7.4.2 D.2 主要實驗儀器
包括以下幾種：
a） 組織研磨器；
b） 離心機；
c） 蛋白電泳／電轉裝置。
7.4.3 D.3 腦組織的提取和處理
腦組織的研磨、提取應在生物安全二級以上實驗室中進行。操作人員需穿戴防護工作服、防護口罩、眼睛防護裝置、雙層手套、防護鞋套等。如果需要振盪器，應使用低功率擋；冰凍腦組織應在生物安全櫃內解凍，切取少量組織（<100 mg=放入凍存管，稱重；具體操作按如下順序進行：
a） 按1：10（m/V）比例加入適量的提取緩衝液，將組織轉移到組織研磨器，製備10%的腦組織勻漿。研磨器使用後在2 mol/L NaOH或5%NaClO（20000μg/g遊離氯）溶液中浸泡至少1h。
b） 腦組織勻漿轉移到凍存管，4℃，2000 r/min離心，10 min。
c） 收集上清液，-20℃保存。所有使用的試管、移液器頭浸入2 mol/L NaOH或50/NaClO （20000μg/g遊離氯）溶液中浸泡至少1h。
7.4.4 D.4 蛋白酶K水解及電泳、電轉
按如下步驟操作：
a） 腦組織勻漿中加入終濃度20μg/mL的蛋白酶K，37℃作用1 h～2 h。
b） 加入等體積的2×上樣緩衝液，100℃煮沸10 min。
c） 常規制備15%分離膠和5%濃縮膠。常規上樣，使用濃縮膠80 V，分離膠156 V的電壓條件下電泳2h。200mA穩流70min（溼式）或60mA 60min（半乾式）電轉移到硝酸纖維素膜。
7.4.5 D.5 蛋白印跡反應
按如下步驟操作：
a） 轉膜完畢，膜用5%脫脂奶緩衝液（20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，0.15 mmol/L NaCl，0.05%Tween 20）溶液封閉過夜。
b） 與1:8000稀釋的PrP特異性單克隆抗體（如3F4抗體），室溫振盪孵育2h或4℃孵育過夜。緩衝液洗3次，共30 min。
c） 與辣根過氧化物酶標記的抗鼠IgG二抗（用緩衝液進行1：10000稀釋）室溫振盪孵育2h。緩衝液洗3次，共30 min。
7.4.6 D.6 結果判定
陽性對照採用羊瘙癢病毒株263K感染倉鼠腦組織提取物，或確診的CJD病人腦組織提取物。陰性對照爲正常倉鼠腦組織提取物，或非CJD病人腦組織提取物。陽性、陰性對照的處理、蛋白酶K水解及蛋白印跡反應按D.3、D.4、D.5進行。
腦組織提取物經蛋白酶K水解後仍在17 KD～27 KD位置出現多條（一般爲三條）顯色蛋白條帶，與未經蛋白酶K消化的PrP蛋白顯色條帶（一般爲三條，電泳遷移位置在30 KD～35 KD左右）相比，蛋白酶處理的PrP顯色條帶的泳動位置明顯下移。以此可判定腦組織中PrPSc蛋白呈陽性。
7.5 附錄E（規範性附錄） vCJD患者扁桃體PrPSc的Western blot檢測
7.5.1 E.1 原理
PrPSc蛋白具有抵抗蛋白酶K水解且經蛋白酶K消化後分子量變小的特點。提取扁桃體活檢組織蛋白，經蛋白酶K水解後進行SDS-PAGE電泳。蛋白電泳條帶電轉至硝酸纖維素膜或尼龍膜，與PrP特異性單克隆抗體反應。具有蛋白酶抗性的蛋白條帶顯色後，位置在17 KD～27 KD。
7.5.2 E.2 主要實驗儀器
包括以下幾種：
a） 組織研磨器；
b） 離心機；
c） 蛋白電泳／電轉裝置。
7.5.3 E.3 扁桃體活檢組織的處理
具體操作按如下順序進行：
a） 按1：10（m/V）比例加入適量的提取緩衝液，將扁桃體活檢組織轉移到組織研磨器，製備10% 的組織勻漿。研磨器使用後在2 mol/L NaOH或5%NaClO（20000μg/g遊離氯）溶液中浸泡至少1h。
b） 扁桃體活檢組織勻漿轉移到凍存管，4℃，2000r／min離心，10min。
c） 收集上清液，-20℃保存。所有使用的試管、移液器頭浸入2mol/L NaOH或50/NaClO （20000μg/g遊離氯）溶液中浸泡至少1 h。
7.5.4 E.4 蛋白酶K水解及電泳、電轉
按如下步驟操作：
a） 扁桃體活檢組織勻漿中加入終濃度20μg/mL的蛋白酶K，37℃作用1 h～2 h。
b） 加入等體積的2×上樣緩衝液，100℃煮沸10 min。
c） 常規制備15%分離膠和5%濃縮膠。常規上樣，使用濃縮膠80 V，分離膠156 V的電壓條件下電泳2h。200 mA穩流70 min（溼式）或60 mA 60 min（半乾式）電轉移到硝酸纖維素膜。
7.5.5 E.5 蛋白印跡反應
按如下步驟操作：
a） 轉膜完畢，硝酸纖維素膜用5%脫脂奶緩衝液（ 20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，0.15 mmol/L NaCl，0.050/ Tween 20）溶液封閉過夜。
b） 與1：8000稀釋的PrP特異性單克隆抗體（如3F4抗體），室溫振盪孵育2h或4℃孵育過夜。緩衝液洗3次，共30 min。
c） 與辣根過氧化物酶標記的抗鼠IgG二抗（用緩衝液進行1：10000稀釋）室溫振盪孵育2h。
緩衝液洗3次，共30 min。
7.5.6 E.6 結果判定
陽性對照採用羊瘙癢病毒株263K感染倉鼠腦組織提取物，或確診的CJD病人腦組織提取物。陰性對照爲正常倉鼠腦組織提取物，或非CJD病人腦組織提取物。陽性、陰性對照的處理、蛋白酶K水解及蛋白印跡反應按E.3、E.4、E.5進行。
扁桃體活檢組織提取物經蛋白酶K水解後仍在17 KD～27 KD位置出現多條（一般爲三條）顯色蛋白條帶，與未經蛋白酶K消化的PrP蛋白顯色條帶（一般爲三條，電泳遷移位置在30 KD～35 KD左右）相比，蛋白酶處理的PrP顯色條帶的泳動位置明顯下移。以此可判定扁桃體活檢組織中PrPSc蛋白呈陽性。
扁桃體活檢不建議作爲常規檢查，在腦電圖出現典型的三相波形後不應進行。對臨牀表現與vCJD相似，以及MRI未出現雙側丘腦枕（後結節）高信號病例的診斷有意義。
7.6 附錄F（規範性附錄）vCJD患者扁桃體PrPSc的免疫組織化學檢測
7.6.1 F.1 原理
PrPSc具有抵抗變性劑、蛋白酶的水解作用，組織切片經高壓水解、變性劑或蛋白酶處理破壞PrPc後，以朊蛋白特異性抗體進行免疫組織化學染色，光學顯微鏡下觀測PrPSc蛋白沉積。
7.6.2 F.2 主要實驗儀器
7.6.3 F.3 實驗步驟
實驗操作按如下順序進行：
b） 取出後浸入水中5 min，飽和苦味酸浸泡15 min，除去福爾馬林色素；
c） 水洗3次，每次5 min，除去苦味酸；
d） 3%過氧化氫／甲醇封閉15 min～20 min（阻斷內源性過氧化物酶）；
e） 水洗3次，每次5 min;
f） 高壓水解（121℃，雙蒸水）10 min，或微波爐（高功率擋，雙蒸水）3次，每次5 min;
g） 取出後室溫冷卻；
h） 在含量不小於96%的甲酸中浸泡5 min～10 min（石蠟包埋前未作甲酸處理的標本）；
i） 水洗3次（緩慢水滴洗）；
j） 4 mol/L異硫氰酸胍浸泡2 h（4℃）；
k） 充分水洗；
1） 血清封閉1：100稀釋的正常羊血清／磷酸鹽緩衝液（PBS）封閉20 min
m） 棄封閉液，加第一抗體（用1：100正常羊血清/PBS稀釋）孵育過夜，朊蛋白特異性單克隆抗體（如3F4），稀釋度爲1：500～1：1000;
n） PBS洗3次，每次5 min;
o） 加第二抗體（用1：100正常羊血清/PBS稀釋）孵育30 min，辣根過氧化物酶（HRP）標記的抗兔抗體1：200稀釋，用於多克隆抗體檢測；或HRP標記的抗小鼠抗體1：200稀釋，用於單克隆抗體檢測；
p） PBS洗3次，每次5 min;
r） 蘇木素（輕微）復染；
s） 常規脫水、透明、封片。
7.6.4 F.4 結果觀察及判定
光鏡觀察扁桃體活檢切片中PrPSc蛋白陽性染色呈褐色，分佈可呈散在型、斑塊型和混合型，細胞核呈淡藍色。
扁桃體活檢不建議作爲常規檢查，在腦電圖出現典型的三相波形後不應進行。對臨牀表現與vCJD相似，以及MRI未出現雙側丘腦枕（後結節）高信號病例的診斷有意義。
7.7 附錄G（規範性附錄） PRNP基因序列、129位及219位氨基酸多態性檢測
7.7.1 G.1 血液樣品採集
a）PRNP基因擴增可以使用全血或白細胞。常用抗凝劑爲檸檬酸，也可用其他抗凝劑如EDTA，肝素會對PCR反應起抑制作用。
b） 血液樣品儲存應爲-70℃，在此條件下DNA樣品可長期保存。
c）PCR擴增、血液樣品的處理和儲存應在不同的實驗室（空間）中進行。
7.7.2 G.2 DNA的提取
使用商品化DNA提取試劑盒或其他方法提取血液樣品DNA。在整個提取過程中都應注意防止DNA污染；同時測定提取DNA的濃度。
7.7.3 G.3 PCR
7.7.3.1 G.3.1 PCR反應前注意事項
在整個PCR擴增過程應防止DNA污染，如試管、加樣吸頭、手套等。PCR反應的操作應嚴格按照四區劃分的原則進行試劑分裝、核酸提取、PCR擴增和核酸電泳（必要時）。
7.7.3.2 G.3.2 PCR引物
PRNP因PCR上下游引物如下：
上游引物：5'-GGCAAACCTTGGATGCTGG-3'
下游引物：5'-CCCACTATCAGGAAGATGAGG-3'
標準PCR各種成分（50μL體積）
DNA模板 3μL
PCR底物 25μL
PrP 1-253上游引物 1μL
PrP l-253下游引物 1μL
雙蒸水 20μL
總體積 50μL
7.7.3.3 G.3.3 標準PCR循環條件
PRNP因PCR擴增條件：
94℃ 5 min（預變性）
94℃ 55 s（變性）
55℃ 55 s（退火）
72℃ 55 s（延伸）
循環次數：30個。
7.7.3.4 G.3.4 結果判定
PCR產物長度：759 bp。
7.7.4 G.4 常規基因序列測定
7.8 附錄H（資料性附錄）遺傳或家族型人類朊病毒病PRNP基因突變位點
7.8.1 H.1 gCJD或fCJD
D178N-129V、V180I、V180I+M232R、T183A、T188A、T188K、E196K、E200K、V203I、R208H、V210 I、E211Q、M232R、R148H、4個額外八肽插入、5個額外八肽插入、6個額外八肽插入、7個額外八肽插入及2個八肽重複缺失。
7.8.2 H.2 GSS
P102L、P105L、A117V、G131V、F198S、D202N、Q212P、Q217R、M232T及8個額外八肽插入。
7.8.3 H.3 FFI
D178N-129MM。
H.4 未分類的遺傳或家族型人類朊病毒病
密碼子點突變：H187R，216八肽重複區（9個額外八肽）插入。
7.9 附錄I（資料性附錄）克-雅病的鑑別診斷
7.9.1 I.1 病毒性腦炎
尤其是單純皰疹病毒性腦炎，病人常表現爲精神症狀、癲癇、發燒、認知障礙及頭痛。起病急，進展迅速。病變常位於顳葉內側，也可累及額葉，DWI較T2WI發現病變更敏感，部分影像學表現與CJD類似，但前者常有腦實質的壞死、出血，腰穿顯示腦脊液壓力增高，白細胞和蛋白輕度增高等，根據臨牀病史、腦脊液檢查及影像學表現可予以鑑別。
7.9.2 I.2 橋本腦病
可分爲：血管炎型，表現爲反覆的卒中樣發作如一過性神經功能缺損、失語、癲癇或急性意識障礙；緩慢進展型，隱襲起病，早期表現爲意識模糊、焦慮或癡呆。無局竈性神經功能缺損的體徵，但神經心理測試常提示嚴重的認知功能障礙。兩種類型均可出現癲癇發作、肌陣攣、震顫、昏迷、錐體外系症狀及小腦性共濟失調。特徵是血清抗甲狀腺球蛋白（antithyroglobulin）抗體（TGAb）或抗甲狀腺過氧化物酶（antimicrosomal）抗體（TMAb）的增高，皮質激素治療有效。
7.9.3 I.3 線粒體腦病
主要爲MELAS型（線粒體腦病伴乳酸中毒及卒中樣發作），爲線粒體DNA突變所致，臨牀上可引起亞急性癡呆需與CJD鑑別，患者常有卒中發作、癲癇和偏頭痛，可有癡呆、乳酸中毒等症狀。DWI上可顯示皮層異常高信號，T2WI及FLAIR上顯示腦回明顯腫脹以及層狀壞死，此徵象不符合CJD表現。
7.9.4 I.4 阿爾茨海默病
潛隱起病，早期出現記憶力障礙，病程進展較緩慢，臨牀上以智能損害爲主，伴有精神及行爲改變，輔助檢查中無CJD典型的腦電圖，頭顱MRI顯示以雙側海馬更爲突出的腦萎縮改變，腦脊液14-3-3蛋白陰性。
7.9.5 I.5 血管性癡呆
主要臨牀表現爲與血管事件相關的、階梯性進展的癡呆，但頭顱MRI可見多發性腦梗死以及白質疏鬆。
7.9.6 I.6 中樞神經系統淋巴瘤及其他腦腫瘤
7.9.7 I.7 皮層靜脈血栓形成
一些疾病可引起靜脈血栓性腦病。如硬腦膜動靜脈瘻可引起臨牀上可逆性癡呆，常有顱內壓增高出血、頭痛、癲癇等，但臨牀症狀爲非特異性。MR DWI也可表現有與CJD類似的皮層高信號，腦血管造影檢查可與之鑑別。
7.9.8 I.8 副腫瘤性亞急性小腦變性
特點是亞急性、進行性、雙側性小腦功能障礙，可伴有癡呆。早期頭顱MRI正常，晚期表現小腦萎縮。常見腦脊液淋巴細胞增多、蛋白含量高，常見於肺癌或女性生殖系統腫瘤患者。
8 參考資料
[1] CDC's Diagnostic Criteria for Creutzfeldt-Jakob Disease（CJD）, USA,2010.
[2] National Creutzfeldt-Jakob Disease surveillance Diagnostic Criteria, UK,2010.
[3] World Health Organization. WHO manual for surveillance of human transmissible spongiformencephalopathies including variant Creutzfeldt-Jakob disease, Communicable Disease Surveillance and Response,2003.
