1 拼音
GBZ/T 240.9—2011 huà xué pǐn dú lǐ xué píng jià chéng xù hé shì yàn fāng fǎ dì 9bù fēn ：tǐ wài bǔ rǔ dòng wù xì bāo rǎn sè tǐ jī biàn shì yàn
2 英文參考
Procedures and tests for toxicological evaluations of chemicals—Part 9:In vitro mammalian chromosome aberration test
ICS 13.100
C 52
中華人民共和國國家職業衛生標準 GBZ/T 240.9—2011《化學品毒理學評價程序和試驗方法 第9部分：體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗》（Procedures and tests for toxicological evaluations of chemicals—Part 9:In vitro mammalian chromosome aberration test）由中華人民共和國衛生部於2011年08月19日發佈，自2012年03月01日起實施。
3 前言
根據《中華人民共和國職業病防治法》制定本部分。GBZ/T 240《化學品毒理學評價程序和試驗方法》現分爲以下四十四部分：
——第1部分：總則；
——第2部分：急性經口毒性試驗；
——第3部分：急性經皮毒性試驗；
——第4部分：急性吸入毒性試驗；
——第5部分：急性眼刺激性/腐蝕性試驗；
——第7部分：皮膚致敏試驗；
——第8部分：鼠傷寒沙門氏菌回覆突變試驗；
——第13部分：哺乳動物精原細胞/初級精母細胞染色體畸變試驗；
——第15部分：亞急性經口毒性試驗；
——第16部分：亞急性經皮毒性試驗；
——第17部分：亞急性吸入毒性試驗；
——第18部分：亞慢性經口毒性試驗；
——第19部分：亞慢性經皮毒性試驗；
——第20部分：亞慢性吸入毒性試驗；
——第21部分：致畸試驗；
——第22部分：兩代繁殖毒性試驗；
——第24部分：慢性經口毒性試驗；
——第25部分：慢性經皮毒性試驗；
——第27部分：致癌試驗；
——第28部分：慢性毒性/致癌性聯合試驗；
——第29部分：毒物代謝動力學試驗；
——第33部分：果蠅伴性隱性致死試驗；
——第35部分：體外哺乳動物細胞程序外DNA合成（UDS）試驗；
——第42部分：一代繁殖試驗；
本部分爲GBZ/T 240的第9部分。本部分的附錄A是資料性附錄。
本部分由衛生部職業衛生標準專業委員會提出。
本部分由中華人民共和國衛生部批准。
本部分起草單位：廣西職業病防治研究所、中國疾病預防控制中心職業衛生與中毒控制所。
本部分主要起草人：葛憲民、孫金秀、常兵、林錚。
5 2 規範性引用文件
下列文件對於本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用於本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用於本文件。
GBZ/T 224 職業衛生名詞術語
6 3 術語和定義
GBZ/T 240.1界定的術語和定義適用於本文件。
3.1
染色體型畸變 chromosome-type aberration
3.2
染色單體型畸變 chromatid-type aberration
3.3
染色體數目畸變 chromosomal numerical aberration
3.4
染色體結構畸變 chromosomal structure aberration
通過顯微鏡可以直接觀察到的發生在細胞有絲分裂中期的染色體的結構變化。如染色體中間缺失和斷片，染色體互換和內交換等。
3.5
有絲分裂指數 mitotic index
9 6 試驗方法
9.1 6.1 受試樣品處理
受試樣品一般應新鮮配製。如果溶液貯存穩定，可以不必新鮮配製。固體受試樣品應溶解或懸浮於適合的溶劑中，並稀釋至一定濃度。液體受試樣品可直接使用或予以稀釋。
9.2 6.2 劑量水平
受試樣品至少應取3個檢測劑量，檢測範圍建議覆蓋兩個10倍稀釋系列。對有細胞毒性的受試樣品，其劑量範圍應包括從最大毒性至幾乎無毒性；當收穫細胞時，高劑量應能明顯減少細胞計數或有絲分裂指數（均應大於50%）；對無細胞毒性或細胞毒性很小的化合物，高劑量應達到5μL/mL、5 mg/mL或0.01 mol/L。應在預試驗中確定細胞毒性和溶解度。測定細胞毒性可使用指示細胞完整性和生長情況的指標，如相對集落形成率或相對細胞生長率等。應在S9系統存在或不存在的條件下測定細胞毒性。對於相對不溶解的物質，當達到不溶解濃度時仍無毒性，則高劑量應採用最終培養液中溶解度限值以上的一個濃度。在某些情況下，應使用一個以上可見沉澱的濃度，溶解性可用肉眼鑑別，但沉澱不能影響觀察。
9.3 6.3 對照組
9.3.1 6.3.1 陽性對照
可根據受試樣品的性質和結構選擇適宜的陽性對照物，應是已知的斷裂劑，能引起可檢出的、並可重複的陽性結果。
——甲磺酸甲酯（methyl methanesulphonate）；
——甲磺酸乙酯（ethyl methanesulphonate）；
——絲裂黴素C（mytomycin C）；
——乙基亞硝基脲（ethyl nitrosourea）；
——4-硝基喹啉-N-氧化物（4-nitroquinoline-N-oxide）等。
——苯並（a）芘（benzo（a）pyrene）；
——環磷酰胺（cyclophosphamide）等。
9.3.2 6.3.2 陰性對照
a） 介質對照：介質應爲非致突變物，不與受試樣品發生化學反應，不影響細胞存活和S9活性。首選介質是水或水溶性溶劑，亦可使用二甲基亞碸（DMSO），但濃度不應大於0.5%。
b） 空白對照：如果沒有文獻資料或歷史資料證實所用介質無致突變作用時應設空白對照。
9.4 6.4 細胞株
可選用中國地鼠肺（CHL）細胞株或卵巢（CHO）細胞株、人或其他哺乳動物外周血淋巴細胞（lymphocyte）。一般推薦使用中國地鼠肺（CHL）細胞株。
9.5 6.5 試劑配製
9.5.1 6.5.1 培養液 MEM （Eagle）
加入非必需氨基酸和抗菌素（青黴素按100 IU/mL、鏈黴素100μg/mL），胎牛血清或小牛血清按10%加入。也可選用其他合適的培養液。
9.5.2 6.5.2 代謝活化系統
9.5.3 6.5.3 0.04%秋水仙素溶液
取40 mg秋水仙素溶解於100 mL無菌0.85%氯化鈉溶液中，過濾除菌。
9.5.4 6.5.4 0.075 mol/L氯化鉀溶液
9.5.5 6.5.5 固定液
9.5.6 6.5.6 姬姆薩染液
取姬姆薩染料3.8 g，置瑪瑙乳鉢中，加少量甲醇研磨。逐漸加甲醇至375 mL，待完全溶解後，再加125 mL甘油，放入37℃溫箱中保溫48 h。保溫期間振搖數次，使充分溶解。取出過濾，2周後使用，作爲姬姆薩染液原液。使用時，取1份姬姆薩染液原液，與9份1/15 mol/L磷酸鹽緩衝液（pH6.8）混合，配成其應用液。
磷酸鹽緩衝液（1/15 mol/L，pH6.8）配製方法如下：
——第一液：取磷酸氫二鈉9.47 g溶於蒸餾水1000 mL中，配成1/15 mol/L溶液。
——第二液：取磷酸二氫鉀49.07 g溶於蒸餾水1000 mL中，配成1/15 mol/L溶液。
取第一液49.5 mL加於第二液50.5 mL中混勻，即爲pH6.8的1/15 mol/L緩衝液。
9.6 6.6 試驗步驟
9.6.1 6.6.1 細胞培養與染毒
試驗需在加入和不加入S9的條件下進行。試驗前一天，將一定數量的細胞接種於培養皿（瓶）中，放CO2培養箱內培養。試驗時吸去培養皿（瓶）中的培養液，加入一定濃度的受試樣品、S9混合液（不加S9混合液時，需用培養液補足）以及一定量不含血清的培養液，放培養箱中，根據細胞週期決定處理2 h～6 h。結束後，吸去含受試樣品的培養液，用Hanks液洗細胞3次，加入含10%胎牛血清的培養液，放回培養箱，於24 h或48 h內收穫細胞。收穫前2 h～4 h，加入細胞分裂中期阻斷劑（如用秋水仙素，作用時間爲4h，終濃度爲1μg/ mL）。
如果在上述加入和不加入S9混合液的條件下均獲得陰性結果，則需加做長時間處理的試驗，即在沒有S。混合液的條件下，使受試樣品與試驗系統的接觸時間延長至24 h。當難以得出明確結論時，應更換試驗條件，如改變代謝活化條件、受試樣品與試驗系統接觸時間等重複試驗。
9.6.2 6.6.2 收穫細胞與製片
6.6.2.1 消化：用0.25%胰蛋白酶溶液消化細胞，待細胞脫落後，加入含10%胎牛或小牛血清的培養液終止胰蛋白酶的作用，混勻，放入離心管以1000 r/min～1200 r/min的速度離心5 min～7 min，棄去上清液。
6.6.2.2 低滲：加入0.075 mol/L KCl溶液7 mL，用滴管將細胞輕輕地混勻，放入37℃水浴中低滲處理10 min～15 min，加入2 mL固定液（甲醇：冰醋酸3:1）混勻，以1500 r/min速度離心5 min～7 min，棄去上清液。
6.6.2.3 固定：加入7 mL固定液，混勻後固定7 min，以1500 r/min速度離心7 min，棄去上清液。用同法再固定1次～2次，棄去上清液。
6.6.2.4 滴片：加入數滴新鮮固定液，混勻。用混懸液滴片，自然乾燥。
6.6.2.5 染色：用姬姆薩染液染色。
9.6.3 6.6.3 鏡檢
每一劑量組選擇200個分散良好的中期分裂相，在顯微鏡油鏡下進行讀片。在讀片時應記錄每一觀察細胞的染色體數目，對於畸變細胞還應記錄顯微鏡視標位置及畸變類型。所有處理組、陽性和陰性對照組均需測定有絲分裂指數。每一劑量組應分析不少於1000個分散良好的中期分裂相。
10 7 數據處理與結果評價
10.1 7.1 數據處理
結果數據的計算指標包括每個細胞染色體畸變數、染色體結構異常百分率、各劑量組及對照組不同類型染色體異常數與頻率等。分裂細胞數應另計，一般不包括在總異常頻率中。所得各組的染色體畸變率用X2檢驗進行統計學處理，以評價劑量組和對照組之間是否有顯著性差異。
10.2 7.2 結果評價
a） 受試樣品引起染色體結構畸變數的增加具有統計學意義，並有與劑量相關的增加；
b） 受試樣品在任何一個劑量條件下，引起染色體結構畸變數的增加具有統計學意義，並有可重複性。評價時應綜合考慮生物學和統計學意義。
11 8 評價報告
除GBZ/T 240.1規定的一般項目外，評價報告還應包括以下內容：
a） 所用溶劑及其配製、劑量選擇（應說明受試樣品的細胞毒性測定方法、溶解情況等）；
b） 細胞株名稱；
c） 試驗條件和方法；
一一陽性對照物名稱和選用濃度，陰性（溶劑）對照物名稱及使用濃度；
d） 簡述製片方法；
e） 毒性特徵、細胞週期資料、分裂指數、受試樣品的pH值、畸變（包括裂隙分析）、各試驗組（劑量組、陽性組、陰性組）染色體畸變數目及畸變類型、畸變範圍、劑量一反應關係、統計處理方法、本實驗室歷史上的染色體畸變率範圍、均值和標準差（說明樣品數）；
f） 結論。
13 附錄A（資料性附錄）大鼠肝微粒體酶的誘導和S9的製備
13.1 A.1 誘導
應用最廣泛的大鼠肝微粒體酶的誘導劑是多氯聯苯（PCB）混合物，選擇健康雄性大鼠體重200 g左右，一次腹腔注射誘導劑500 mg/kg。誘導劑溶於玉米油中，濃度爲200 mg/ mL。
13.2 A.2 S9製備
動物誘導後第五日斷頭處死。處死前12 h停止飲食，但可自由飲水。首先，用75%酒精消毒動物皮膚，剖開腹部。在無菌條件下，取出肝臟，去除肝臟的結締組織，用冰浴的0.15 mol/L氯化鉀淋洗肝臟，放入盛有0.15 mol/L氯化鉀溶液的燒杯裏。按每克肝臟加入0.15 mol/L氯化鉀溶液3 mL。用電動勻漿器製成肝勻漿，再在低溫高速離心機上，在4℃條件下，以9000 g離心10 min，取其上清液分裝於塑料管中。每管裝2 mL～3 mL。儲存於液氮生物容器中或-80℃冰箱中備用。
上述全部操作均在冰水浴中和無菌條件下進行。製備肝S9所用一切手術器械、器皿等，均經滅菌消毒。S9製備後，其活力需經診斷性誘變劑進行鑑定。