1 拼音
GBZ/T 240.12—2011 huà xué pǐn dú lǐ xué píng jià chéng xù hé shì yàn fāng fǎ dì 12bù fēn ：tǐ nèi bǔ rǔ dòng wù gǔ suǐ xì bāo rǎn sè tǐ jī biàn shì yàn
2 英文參考
Procedures and tests for toxicological evaluations of chemicals—Part 12:In vivo mammalian bone marrow chromosome aberration test
ICS 13.100
C 52
中華人民共和國國家職業衛生標準 GBZ/T 240.12—2011《化學品毒理學評價程序和試驗方法 第12部分：體內哺乳動物骨髓細胞染色體畸變試驗》（Procedures and tests for toxicological evaluations of chemicals—Part 12:In vivo mammalian bone marrow chromosome aberration test）由中華人民共和國衛生部於2011年08月19日發佈，自2012年03月01日起實施。
3 前言
根據《中華人民共和國職業病防治法》制定本部分。GBZ/T 240《化學品毒理學評價程序和試驗方法》現分爲以下四十四部分：
——第1部分：總則；
——第2部分：急性經口毒性試驗；
——第3部分：急性經皮毒性試驗；
——第4部分：急性吸入毒性試驗；
——第5部分：急性眼刺激性/腐蝕性試驗；
——第7部分：皮膚致敏試驗；
——第8部分：鼠傷寒沙門氏菌回覆突變試驗；
——第13部分：哺乳動物精原細胞/初級精母細胞染色體畸變試驗；
——第15部分：亞急性經口毒性試驗；
——第16部分：亞急性經皮毒性試驗；
——第17部分：亞急性吸入毒性試驗；
——第18部分：亞慢性經口毒性試驗；
——第19部分：亞慢性經皮毒性試驗；
——第20部分：亞慢性吸入毒性試驗；
——第21部分：致畸試驗；
——第22部分：兩代繁殖毒性試驗；
——第24部分：慢性經口毒性試驗；
——第25部分：慢性經皮毒性試驗；
——第27部分：致癌試驗；
——第28部分：慢性毒性/致癌性聯合試驗；
——第29部分：毒物代謝動力學試驗；
——第33部分：果蠅伴性隱性致死試驗；
——第35部分：體外哺乳動物細胞程序外DNA合成（UDS）試驗；
——第42部分：一代繁殖試驗；
本部分爲GBZ/T 240的第12部分。
本部分由衛生部職業衛生標準專業委員會提出。本部分由中華人民共和國衛生部批准。
本部分起草單位：湖南省勞動衛生職業病防治所、中國疾病預防控制中心職業衛生與中毒控制所。
本部分主要起草人：陸丹、孫金秀、常兵、林錚。
5 2 規範性引用文件
下列文件對於本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用於本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用於本文件。
GBZ/T 224 職業衛生名詞術語
6 3 術語和定義
GBZ/T 240.1界定的術語和定義適用於本文件。
3.1
染色單體型畸變 chromatid-type aberration
3.2
染色體型畸變 chromosome-type aberration
爲在兩個染色單體的相同位點均出現斷裂或斷裂重組改變的結構損傷。
3.3
核內複製 endoreduplication
在DNA複製的S期之後，細胞核未進行有絲分裂就開始了另一個S期的過程。其結果是染色體有4，8，16，…倍的染色質。
3.4
裂隙 gap
染色體或染色單體損傷的長度小於一個染色單體的寬度，爲染色單體的最小的錯誤排列。
3.5
染色體數目畸變 chromosomal numerical aberration 染色體數目發生改變，不同於正常核型。
3.6
多倍體 polyploidy
哺乳動物染色體數目正常是二倍體，在化學誘變劑的作用下，染色體數目成倍地增加成三倍體、四倍體等。
3.7
染色體結構的畸變 cbromosomal structure aberration
8 5 試驗概述
動物通過適當的途徑接觸受試樣品，一定時間後處死動物。動物處死前，用細胞分裂中期阻斷劑處理，處死後取出骨髓，經低滲、固定後製備骨髓細胞染色體標本，經染色，在顯微鏡下觀察中期分裂相細胞，分析細胞染色體畸變。
9 6 試驗方法
9.1 6.1 試劑
6.1.5 姬姆薩（Giemsa）染液：
Giemsa染料 3.8 g
甲醇 375 mL
甘油 125 mL
配製：將Giemsa染料和少量甲醇於乳鉢裏仔細研磨，再加入甲醇至375 mL，待完全溶解後，再加入125 mL甘油，混合均勻。置37℃恆溫箱中保溫48 h。保溫期間振搖數次，促使染料的充分溶解。取出過濾，兩週後使用。
6.1.6 磷酸緩鹽衝液（pH 7.4）：
1/15 mol/L磷酸氫二鈉溶液：磷酸氫二鈉（Na2HPO4）9.47 g溶於1000 mL蒸餾水中。
1/15 mol/L磷酸二氫鉀溶液：磷酸二氫鉀（KH2PO4）49.07 g溶於1000 mL蒸餾水中。
取1/15 mol/L磷酸氫二鈉溶液80 mL與1/15 mol/L磷酸二氫鉀溶液20 mL混合。
6.1.7 Giemsa應用液：
取1份Giemsa染液與9份1/15 mol/L磷酸緩鹽衝液混合而成。臨用時配製。
9.2 6.2 受試樣品處理
受試樣品一般應新鮮配製。如果有資料證明以溶液貯存穩定，可以不必新鮮配製。固體受試樣品應溶於或懸於適當的溶劑或載體中，並進行稀釋。液體受試樣品可直接使用或稀釋後使用。根據受試樣品的理化性質（水溶性/脂溶性）確定受試樣品所用的溶劑或載體。但所用溶劑或載體在使用劑量水平對實驗動物應不產生毒作用，且不與受試樣品發生任何化學反應。通常用蒸餾水、等滲鹽水、植物油、食用澱粉、羧甲基纖維素鈉等。如非常用的溶劑或載體，應有參考資料說明其成分及選做溶劑的原因。
10 6.3 對照
6.3.1 每次試驗每一性別都應設置相應的陽性和陰性對照（溶劑/載體），除不使用受試樣品外，其他處理與受試樣品組一致。
6.3.2 陽性對照組動物體內應能形成可被檢測的高於背景的骨髓細胞染色體結構畸變。陽性對照組劑量設置應使致染色體畸變效應明顯，但以不能使看片者一看即知編碼玻片底細。可只取一個採樣點來證明陽性對照。最好使用與受試樣品化學分類相關的陽性對照化合物。常用的陽性對照物有：
——甲磺酸乙酯（ethyl methanesulphonate，CAS號62-50-0）；
——乙基亞硝基脲（ethyl nitrosourea，CAS號759-73-9）；
——絲裂黴素C（mitomycin C，CAS號50-07-7）；
——環磷酰胺（cyclophosphamide，CAS號50-18-0）；
——單水環磷酰胺（cyclophosphamide monohydrate，CAS號6055-19-2）；
——三亞乙基嘧胺（triethylenemelamine，CAS號51-18-3）。
6.3.3 陰性對照由溶劑或載體組成。是否在每個採樣時間點均設置陰性對照，可依據動物間的變異和歷史對照資料中的細胞染色體畸變頻率判斷。如果採用一個採樣時間點作陰性對照，最適採樣時間點是第一採樣時間點。另外，如果沒有歷史對照資料證明所用溶劑或載體無誘導缺失或突變效應，還應設空白對照。
10.1 6.4 實驗動物和飼養環境
6.4.1 實驗動物：大鼠、小鼠和中國倉鼠是骨髓細胞染色體畸變試驗常規使用動物，其他合適的哺乳動物也可選用。應使用健康年輕的成熟動物，如使用小鼠，周齡7周～l2周爲最好。試驗初始，動物體重變化應儘量小，即不能超過雌雄動物平均體重的20%。動物應隨機分組，每個處理組和對照組每性別都應有至少5只能用於分析的動物。如試驗設有幾個採樣時間點，則要求每組每性別每個採樣時間點都有5只能用於分析的動物。如果有資料證明兩性別間毒性作用無差別，則可只用一種性別的動物做試驗。對人羣暴露有性別差異的化學物質，如某些藥劑，則要用相應性別的動物做試驗。動物購回後應適應實驗室新環境至少3 d～5 d。
6.4.2 實驗動物和動物實驗的環境設施應符合國家相應規定，應有合理的動物管理措施並嚴格控制環境條件，儘量減少人員流動。飼養條件、疾病、藥物治療、飼料的雜質、空氣、飲水、墊料等都可能對試驗結果產生巨大影響。
10.2 6.5 劑量水平
6.5.1 應進行預試驗以選擇高劑量，爲避免出現假陰性結果應適當增大劑量範圍。如果受試樣品具有毒性，應在第一個採樣時間點在最大毒性至最小毒性或無毒性的範圍內設三個劑量。第二次採樣時間點僅需設置高劑量。高劑量是能使動物出現嚴重中毒反應的劑量。而有特異生物學活性的物質，在低或無毒劑量（如激素和絲裂源）可採用其他劑量設置標準。高劑量也可爲能在骨髓中產生明顯毒性的劑量（如抑制骨髓細胞有絲分裂指數達50%以上）。按等比級數2向下設置中、低劑量組。
6.5.2 如劑量水平大於或等於2000 mg/kg體重，24 h內進行一次或兩次染毒，不產生可觀察到的毒性效應，並且根據結構相關物質的資料不能推斷受試樣品有遺傳毒性，則不必設三個劑量。如染毒14 d則高劑量選用每天2000 mg/kg，染毒14 d以上高劑量選用每天1000 mg/kg。如欲外推人羣接觸的閾劑量，可能需要採用更高的劑量水平。
10.3 6.6 試驗步驟
10.3.1 6.6.1 實驗動物的處理和採樣時間點
6.6.1.1 根據試驗目的或受試樣品的性質選擇染毒途徑，宜採用經口灌胃或腹腔注射方式。
6.6.1.2 受試樣品一次給予的最大容量不應超過20 mL/kg。
6.6.1.3 一般情況下染毒一次，或者爲便於大容量給藥，也可分散劑量染毒，即同一日染毒兩次，其間隔時間不超過幾小時。若採用其他染毒方式應予以說明。
6.6.1.4 高劑量組動物分爲A、B兩個亞組，分兩次採集樣品，齧齒類動物採樣時間一般爲1.5個正常細胞週期的間隔期，即A組於末次染毒後12 h～18 h採集樣品。B組於末次染毒後36 h～42 h採集樣品；中、低劑量組均於末次染毒後12 h～18 h採集樣品。如果採用多次染毒方式，只需在最後一次染毒後12 h～18 h採一次樣。
6.6.1.5 於處死動物採集樣品前3 h～5 h腹腔注射秋水仙素（4 mg/kg）。
10.3.2 6.6.2 製片
6.6.2.1 骨髓細胞懸液的製備：用頸椎脫臼法處死動物，迅速取出股骨，剔去肌肉，擦淨血污，剪去兩端的骨骺，用注射器吸取生理鹽水，插入骨髓腔內，將骨髓沖洗入離心管，然後用吸管吹打骨髓團塊使其均勻，以1000 r/min速度離心10 min，用滴管吸去上清液。
6.6.2.2 低滲：加入0.075 mol/L氯化鉀溶液9 mL，用滴管將細胞輕輕地混勻，放入37℃水浴中低滲20 min。
6.6.2.3 預固定：立即加入固定液（甲醇：冰醋酸=3：1）1 mL，混勻，以1000 r/min速度離心10 min，用滴管吸去上清液。
6.6.2.4 固定：加入7 mL固定液，混勻，固定10 min～20 min，以1000 r/min速度離心10 min，用滴管吸去上清液。用同法再固定2次。
6.6.2.5 加入0.1 mL～0.5 mL新鮮固定液，用細口滴管充分混勻。
6.6.2.6 在潔淨的冷凍玻片上滴3滴～4滴細胞懸液，輕吹細胞懸液擴散平鋪於玻片上，將玻片在酒精燈上微熱烘烤，空氣中自然乾燥。每個標本製片2張～3張。
6.6.2.7 染色：將製備好的標本片放入Giemsa應用液中染色15 min～20 min，用蒸餾水沖洗、晾乾。
10.3.3 6.6.3 閱片
6.6.3.1 所有玻片，包括陽性對照和陰性對照，在鏡檢前要分別編號。
6.6.3.2 在低倍鏡下檢查製片質量，製片應全部染色體較集中，而各個染色體分散、互不重疊、長短收縮適中、兩單體分開、清晰地顯示出着絲點位置、染色體呈紅紫色。用油鏡進行細胞中期染色體分析。
6.6.3.3 確定有絲分裂指數；包括所有處理組、陰性對照組和陽性對照組（每隻動物計數1000個細胞）。
6.6.3.4 計數畸變細胞：用雙盲法閱片。每隻動物至少分析100個分散良好的中期分裂相細胞，每隻動物至少分析1000個細胞，測定有絲分裂釋放以確定細胞毒性。在閱片時應記錄每一觀察細胞的染色體數目，對於畸變細胞還應記錄顯微鏡視野的座標位置及畸變類型。
6.6.3.5 觀察項目：
a） 染色體數目的改變：非整倍體（亞二倍體或超二倍體），多倍體，核內複製。
b） 染色體結構的改變：斷裂、微小體、有着絲點環、無着絲點環、單體互換、雙微小體、裂隙和非特定性型變化（如粉碎化、着絲點細長化、粘着等）。
11 7 數據處理與結果評價
11.1 7.1 數據處理
每一實驗動物作爲一個觀察單位，每組動物按性別分別計算染色體結構畸變細胞百分率。若雌、雄動物之間無明顯的性別差異時可合併計算結果。一般用卡方檢驗方法進行統計學分析。裂隙應分別記錄和報告，但一般不計入總的畸變率。
11.2 7.2 結果評價
評價時應從生物學意義和統計學意義兩個方面進行分析。受試樣品組細胞染色體畸變率與陰性對照組相比，細胞染色體結構畸變數增加或異常中期分裂相增加，統計學意義上有顯著性差異，並呈劑量一反應關係或在一個受試樣品組出現染色體畸變細胞數明顯增高時，並經重複試驗證實，即可認爲染色體畸變試驗陽性。若統計學上差異有顯著性，但無劑量一反應關係，則須進行重複試驗，結果能重複者可確定爲染色體畸變試驗陽性。
12 8 評價報告
除GBZ/T 240.1規定的一般項目外，評價報告還應包括以下內容：
a） 受試樣品穩定性、配製方法、所用溶劑或載體及其選擇的理由、受試樣品在溶劑中的溶解度和飽和度；
b） 實驗動物種屬／品系、數量、年齡、性別、試驗開始時各動物的體重（包括體重範圍、每組動物體重平均值和標準差）、來源（註明合格證號和動物級別）；
c） 實驗動物飼養環境，包括飼料來源（註明合格證號）、飲水質量、室溫、相對溼度、動物實驗室合格證號；
d） 劑量分組及選擇劑量的基本原則，陽性和陰性對照資料（包括當前和歷史的資料）、染毒途徑和方式，採樣時點；
f） 試驗方法：簡述操作步驟，所用統計學方法，結果判定標準；
g） 結果：中毒症狀、有絲分裂指數、每隻動物細胞染色體畸變類型和畸變數、每組動物細胞畸變總數及均數和標準差、每組畸變細胞數及均值和標準差、多倍體、劑量一反應關係、陰性對照的參考資料、歷史資料及範圍、均值和標準差、陽性對照的參考資料等。以列表方式報告受試樣品組、溶劑對照組和陽性對照組動物骨髓細胞染色體畸變類型和數量及畸變率；
h） 結論。