1 拼音
GBZ/T 240.11—2011 huà xué pǐn dú lǐ xué píng jià chéng xù hé shì yàn fāng fǎ dì 11bù fēn ：tǐ nèi bǔ rǔ dòng wù gǔ suǐ shì duō rǎn hóng xì bāo wēi hé shì yàn
2 英文參考
Procedures and tests for toxicological evaluations of chemicals—Part 11:In vivo mammalian erythrocyte micronucleus test
ICS 13.100
C 52
中華人民共和國國家職業衛生標準 GBZ/T 240.11—2011《化學品毒理學評價程序和試驗方法 第11部分：體內哺乳動物骨髓嗜多染紅細胞微核試驗》（Procedures and tests for toxicological evaluations of chemicals—Part 11:In vivo mammalian erythrocyte micronucleus test）由中華人民共和國衛生部於2011年08月19日發佈，自2012年03月01日起實施。
3 前言
根據《中華人民共和國職業病防治法》制定本部分。
GBZ/T 240《化學品毒理學評價程序和試驗方法》現分爲以下四十四部分：
——第1部分：總則；
——第2部分：急性經口毒性試驗；
——第3部分：急性經皮毒性試驗；
——第4部分：急性吸入毒性試驗；
——第5部分：急性眼刺激性／腐蝕性試驗；
——第7部分：皮膚致敏試驗；
——第8部分：鼠傷寒沙門氏菌回覆突變試驗；
——第13部分：哺乳動物精原細胞／初級精母細胞染色體畸變試驗；
——第15部分：亞急性經口毒性試驗；
——第16部分：亞急性經皮毒性試驗；
——第17部分：亞急性吸入毒性試驗；
——第18部分：亞慢性經口毒性試驗；
——第19部分：亞慢性經皮毒性試驗；
——第20部分：亞慢性吸入毒性試驗；
——第21部分：致畸試驗；
——第22部分：兩代繁殖毒性試驗；
——第24部分：慢性經口毒性試驗；
——第25部分：慢性經皮毒性試驗；
——第27部分：致癌試驗；
——第28部分：慢性毒性／致癌性聯合試驗；
——第29部分：毒物代謝動力學試驗；
——第33部分：果蠅伴性隱性致死試驗；
——第35部分：體外哺乳動物細胞程序外DNA合成（UDS）試驗；
——第42部分：一代繁殖試驗；
本部分爲GBZ/T 240的第11部分。
本部分由衛生部職業衛生標準專業委員會提出。
本部分由中華人民共和國衛生部批准。
本部分起草單位：湖南省勞動衛生職業病防治所、廣西職業病防治研究所、中國疾病預防控制中心職業衛生與中毒控制所。
本部分主要起草人：陸丹、陳曉琴、孫金秀、常兵、林錚。
5 2 規範性引用文件
下列文件對於本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用於本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用於本文件。
GBZ/T 224 職業衛生名詞術語
6 3 術語和定義
GBZ/T 240.1界定的術語和定義適用於本文件。
3.1
微核 micronucleus
在細胞的有絲分裂後期染色體有規律地進入子細胞形成細胞核時，仍然滯留在細胞質中的染色單 體或染色體的無着絲點斷片，或因紡錘體受損而丟失的整條染色體。它在末期以後，單獨形成一個或幾 個規則的次核，被包含在子細胞的胞質內而形成，因比主核小，故稱爲微核。
3.2
着絲粒 centromere/kinetochore
細胞分裂中期染色體上紡錘絲附着的區域，藉此子代染色體得以有規律地向子代細胞兩極移動。
3.3
正染紅細胞 normochromatic erythrocyte，NCE
3.4
嗜多染紅細胞 polychromatic erythrocyte，PCE
9 6 試驗方法
9.1 6.1 試劑
9.1.1 6.1.1 小牛血清（滅活）
小牛血清濾菌後置於56℃恆溫水浴保溫30 min進行滅活。滅活的小牛血清通常貯存於4℃冰箱裏。亦可用大鼠、小鼠血清代替。
9.1.2 6.1.2 姬姆薩（Giemsa）染液
Giemsa染料 3.8 g
甲醇 375 mL
甘油 125 mL
配製：將Giemsa染料和少量甲醇於乳鉢裏仔細研磨，再加入甲醇至375 mL，待完全溶解後，再加入125 mL甘油，混合均勻。置37℃恆溫箱中保溫48 h。保溫期間振搖數次，促使染料的充分溶解。取出過濾，兩週後使用。
9.1.3 6.1.3 磷酸鹽緩衝液（pH6.8）
1/15 mol/L磷酸氫二鈉溶液：磷酸氫二鈉（Na2HPO4）9.47 g溶於1000 mL蒸餾水中。
1/15 mol/L磷酸二氫鉀溶液：磷酸二氫鉀（KH2PO4）49.07 g溶於1000 mL蒸餾水中。
取1/15 mol/L磷酸氫二鈉溶液50 mL與1/15 mol/L磷酸二氫鉀溶液50 mL混合。
9.1.4 6.1.4 Giemsa應用液
取1份Giemsa染液與9份1/15 mol/L磷酸鹽緩衝液混合而成。臨用時配製。
9.1.5 6.1.5 甲醇（分析純）
9.2 6.2 受試樣品處理
通常用蒸餾水、等滲鹽水、植物油、食用澱粉、羧甲基纖維素鈉等。如使用特殊溶劑或載體，應有參考資料說明其成分。
9.3 6.3 實驗動物
常規選用成年的健康小鼠或大鼠。
9.4 6.4 劑量設計
至少設置三個劑量組，高劑量組應達到不產生動物死亡的最大毒作用劑量。一般取受試樣品1/2 LD50或低於1/2 LD50的劑量，以求獲得微核的劑量一反應關係曲線。當受試樣品的LD50大於5 g/kg體
重時，可取5 g/kg體重爲高劑量，每個劑量組10只動物，雌性、雄性各半，同時應設陽性對照和陰性對照。陽性對照物應能引起骨髓嗜多染紅細胞微核率明顯高於背景資料，染毒途徑可以不同於受試樣品。所選用的陽性對照物最好與受試樣品類別有關，常使用的陽性對照物有：
一一一環磷酰胺（cyclophosphamide，CAS號50-18-0）；
——甲磺酸乙酯（ethyl methanesulphonate，CAS號62-50-0）；
——乙基亞硝基脲（ethyl nitrosourea，CAS號759-73-9）；
——絲裂黴素C（mitomycin C，CAS號50-07-7）；
一一三亞乙基嘧胺（triethylenemelamine，CAS號51-18-3）等。
9.5 6.5 試驗步驟
9.5.1 6.5.1 染毒
骨髓PCE微核試驗要求給受試樣品後短期內能在骨髓達到有效濃度。常用的方式是腹腔給藥及經口給藥。由於受試樣品的理化性狀各不相同，經各種途徑給藥後吸收速度及分佈也有差異，故可按實際需要，選用合適的給藥途徑。染毒途徑視試驗目的而定，宜採用經口灌胃方式。採用一次給藥，於24 h～48 h之間取材；還可採用30 h兩次給藥法，即兩次給藥間隔24 h，第二次給受試樣品後6h取材。
9.5.2 6.5.2 取材
頸椎脫臼處死動物後，打開胸腔，沿着胸骨柄與肋骨交界處剪斷，剝掉附着其上的肌肉，擦淨血污，橫向剪開胸骨，暴露骨髓腔，然後用止血鉗擠出骨髓液。
9.5.3 6.5.3 標本片製備
9.5.3.1 6.5.3.1 骨髓塗片
將骨髓液滴在載玻片一端的小牛血清液滴裏，仔細混勻。一般來講，兩節胸骨髓液塗一張玻片爲宜。然後，按血常規塗片法塗片，長度約2 cm～3 cm。在空氣中晾乾。
9.5.3.2 6.5.3.2 固定
將乾燥的塗片放入甲醇液中固定5 min～10 min。即使當日不染色，也應固定後保存。
9.5.3.3 6.5.3.3 染色
將固定過的塗片放入Glemsa應用液中染色10 min～15 min。立即用蒸餾水沖洗，晾乾。
9.5.3.4 6.5.3.4 封片
待染片完全乾燥後或用濾紙及時擦乾染片背面的水滴，再用雙層濾紙輕輕按壓染片，以吸附染片上殘留的水分，再在空氣中晃動數次，以促其儘快晾乾，然後放入二甲苯中透明5 min，取出滴上適量光學樹膠，蓋上蓋玻片，寫好標誌。
9.6 6.5.4 鏡檢
6.5.4.1 本法觀察含微核的嗜多染紅細胞。嗜多染紅細胞呈灰藍色，成熟紅細胞呈淡桔紅色。微核大多數呈單個圓形，邊緣光滑整齊，嗜色性與核質相一致，呈紫紅色或藍紫色。選擇細胞分佈均勻，細胞無損，着色適當的區域，再在油鏡下計數。雖然不計數含微核的有核細胞，但需用有核細胞形態染色是否正常作爲判斷製片優劣的標準。
6.5.4.2 應對每個動物的骨髓至少觀察200個紅細胞，計數嗜多染紅細胞在紅細胞總數（嗜多染紅細胞十嗜正染紅細胞）中比例時，嗜多染紅細胞在紅細胞總數中比例不應低於對照值的20%。如果PCE/ NCE<0.1，說明紅細胞生成過程受到抑制，試驗結果不可靠，應重新設計劑量，進行試驗。
6.5.4.3 每隻動物至少計數1000個嗜多染紅細胞。微核率指含有微核的嗜多染紅細胞數，以千分率（‰）表示。若一個嗜多染紅細胞中出現兩個以上微核，仍按一個有微核細胞計數。並應計算正常紅細胞和嗜多染紅細胞的比例。
10 7 數據處理與結果評價
計算各組微核細胞率的均數和標準差，用適當的統計學方法，對受試樣品各劑量組與溶劑對照組的微核率進行比較。如果受試樣品劑量組與對照組相比，統計學上有顯著性差異，並有劑量一反應關係則可認爲微核試驗陽性。