1 拼音
GB 15193.6—2014 shí pǐn ān quán guó jiā biāo zhǔn bǔ rǔ dòng wù gǔ suǐ xì bāo rǎn sè tǐ jī biàn shì yàn
中華人民共和國國家標準 GB 15193.6—2014《食品安全國家標準 哺乳動物骨髓細胞染色體畸變試驗》由中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會於2015年01月28日發佈，自2015年05月01日起實施，同時替代代替GB 15193.6—2003《哺乳動物骨髓細胞染色體畸變試驗》。
2 前言
本標準代替GB 15193.6—2003《哺乳動物骨髓細胞染色體畸變試驗》。本標準與GB 15193.6—2003相比，主要變化如下：
——標準名稱修改爲“食品安全國家標準 哺乳動物骨髓細胞染色體畸變試驗”；
——修改了範圍；
——增加了術語和定義；
——修改了試驗目的和原理；
——修改了試驗方法；
——修改了數據處理。
食品安全國家標準
4 2 術語和定義
4.1 2.1 染色體結構畸變
通過顯微鏡可以直接觀察到的發生在細胞有絲分裂中期的染色體結構變化。如染色體中間缺失和斷片，染色體互換和內交換等。結構畸變可分爲染色體型畸變（chromosome-type aberration）和染色單體型畸變（chromatid-type aberration）。
4.2 2.2 染色體型畸變
染色體結構損傷，表現爲在兩個染色單體的相同位點均出現斷裂或斷裂重組的改變。
4.3 2.3 染色單體型畸變
染色體結構損傷，表現爲染色單體斷裂或染色單體斷裂重組的損傷。
4.4 2.4 染色體數目畸變
4.5 2.5 核內複製
在DNA複製的S期之後，細胞核未進行有絲分裂就開始了另一個S期的過程。其結果是染色體有4、8、16…倍的染色單體。
4.6 2.6 裂隙
染色體或染色單體損傷的長度小於一個染色單體的寬度，爲染色單體的最小錯誤排列。
4.7 2.7 有絲分裂指數
5 3 試驗目的和原理
在試驗動物給予受試物後，用中期分裂相阻斷劑（如秋水仙素或秋水仙胺）處理，抑制細胞分裂時紡錘體的形成，以便增加中期分裂相細胞的比例，隨後取材、製片、染色、分析染色體畸變。
本試驗可檢測受試物能否引起整體動物骨髓細胞染色體畸變，以評價受試物致突變的可能性。若有證據表明受試物或其代謝產物不能到達骨髓，則不適用於本方法。
6 4 儀器和試劑
6.1 4.1 儀器
實驗室常用設備、恆溫水浴鍋（37℃±5℃）、離心機、生物顯微鏡。
6.2 4.2 試劑
4.2.1 秋水仙素（0.4 mg/mL）：置於棕色瓶中，冰箱保存。
4.2.4 姬姆薩（Giemsa）儲備染液：取Giemsa染料3.8 g和少量甲醇於乳鉢裏仔細研磨，逐漸加入甲醇至375 mL，待完全溶解後，再加入125 mL甘油，混合均勻。置37℃恆溫箱中保溫48 h。保溫期間振搖數次，促使染料的充分溶解。取出過濾，室溫保存，兩週後使用。
4.2.5 Giemsa應用染液：取1份Giemsa儲備染液與9份磷酸鹽緩衝液（1/15 mol/L）混合而成。臨用時配製。
4.2.6.1 磷酸氫二鈉溶液（1/15 mol/L）：磷酸氫二鈉（Na2HPO4）9.47 g溶於1000 mL去離子水中。
4.2.6.2 磷酸二氫鉀溶液（1/15 mol/L）：磷酸二氫鉀（KH2PO4）9.07 g溶於1000 mL去離子水中。
4.2.6.3 取磷酸氫二鈉溶液（1/15 mol/L） 50 mL與磷酸二氫鉀溶液（1/15 mol/L） 50 mL混合。
7 5 試驗方法
7.1 5.1 受試物
受試物應使用原始樣品，若不能使用原始樣品，應按照受試物處理原則對受試物進行適當處理。
7.2 5.2 實驗動物
7.2.1 5.2.1 動物選擇
常用健康年輕的成年大鼠或小鼠，如使用小鼠，可選擇7周齡～12周齡，試驗開始時動物體重的差異不應超過平均體重的20%。動物應隨機分組，每組雌性和雄性動物至少各5只。如果試驗設有幾個採樣時間點，則要求每組每個性別每個採樣時間點都有5只能用於分析的動物。
7.2.2 5.2.2 動物準備
試驗前動物在實驗動物房至少應進行3 d～5 d環境適應和檢疫觀察。
7.2.3 5.2.3 動物飼養
實驗動物飼養條件應符合GB 14925、飲用水應符合GB 5749、飼料應符合GB 14924的有關規定。試驗期間動物自由飲水和攝食，每籠動物數應滿足實驗動物最低需要的空間，以不影響動物自由活動和觀察動物的體徵爲宜。
7.3 5.3 劑量
應進行預試驗以選擇最高劑量。如果受試物具有毒性，應設3個劑量，最高劑量組原則上爲動物出現嚴重中毒表現和（或）個別動物出現死亡的劑量，一般可取1/2 LD50，低劑量組應不表現出毒性，分別取1/4 LD50和1/8 LD50作爲中、低劑量。對於在低或無毒劑量下具有特異生物學活性的物質（如激素和絲裂源）可以抑制骨髓細胞有絲分裂指數（50%以上）爲指標確定最高劑量，按等比級數2向下設置中、低劑量組。急性毒性試驗給予受試物最大劑量（最大使用濃度和最大灌胃容量）動物無死亡而求不出LD50，並且根據結構相關物質資料不能推斷受試物具有遺傳毒性時，則不必設3個劑量。按以下順序只設一個劑量：
a） 10 g/kg體重；
b） 人的可能攝入量的100倍；
c） 一次最大灌胃劑量，連續染毒14 d。另設溶媒對照組和陽性對照組，如果沒有文獻資料或歷史性資料證實所用溶媒不具有有害作用或致突變作用，還應設空白對照組。陽性對照物可用絲裂黴素C（1.5 mg/kg體重～2.0 mg/kg體重）或環磷酰胺（40 mg/kg體重）經口或腹腔注射給予。
7.4 5.4 試驗步驟
7.4.1 5.4.1 給予受試物方式
經口給予受試物，受試物溶液一次灌胃量不應超過20 mL/kg體重。採用一次染毒或多次染毒方式。一次染毒應分兩次採集標本，即每組動物分兩個亞組，亞組1於染毒後12 h～18 h處死動物採集第一次標本，亞組2於亞組1動物處死後24 h採集第二次標本。如果採用多次染毒方式，可給予受試物2次～4次，每次間隔24 h，在末次染毒後12 h～18 h採集一次標本。處死動物前3 h～5 h，按4 mg/kg體重腹腔注射秋水仙素。
7.4.2 5.4.2 取材
頸椎脫臼法處死動物，迅速取出股骨，剔去肌肉，擦淨血污，剪去兩端骨骺，用帶針頭的注射器吸取5 mL生理鹽水，插入骨髓腔，將骨髓洗入10 mL離心管，然後用吸管吹打骨髓團塊使其均勻，將細胞懸液以1000 r/min離心10 min，棄去上清液。
7.4.3 5.4.3 低滲
離心後的沉澱物加入7 mL 0.075 mol/L氯化鉀溶液，用滴管將細胞輕輕吹打均勻，放入37℃水浴中低滲10 min～20 min。
7.4.4 5.4.4 預固定
立即加入1 mL～2 mL固定液（甲醇：冰醋酸=3：1），以1000 r/min離心10 min，棄去上清液。
7.4.5 5.4.5 固定
加入7 mL固定液，混勻，固定15 min後，以1000 r/min離心10 min，棄去上清液，用同法再加固定液1次～2次，棄去上清液。
7.4.6 5.4.6 滴片
加入數滴新鮮固定液，用滴管充分混勻。將細胞懸液均勻的滴於冰水玻片上，輕吹細胞懸液擴散平
7.4.7 5.4.7 染色
用Giemsa染液染色15 min，去離子水沖洗，空氣中自然乾燥。
7.4.8 5.4.8 閱片
在低倍鏡下檢查製片質量，製片應爲全部染色體較集中，而各個染色體分散、互不重疊、長短收縮適中、兩條單體分開、清楚地顯示出着絲點位置、染色體呈紅紫色。用油鏡進行細胞中期染色體分析，每隻動物分析100個中期相細胞，每個劑量組不少於1000個中期分裂相細胞。在讀片時應記錄每個觀察細胞的染色體數目，對於畸變細胞還應記錄顯微鏡視野的座標位置及畸變類型。由於低滲等機械作用的破壞，會導致處於中期的染色體發生丟失，所以，觀察的中期相染色體數目應控制在2n±2內。
7.5 5.5 觀察指標
7.5.1 5.5.1 染色體數目的改變
7.5.2 5.5.2 染色體結構的改變
5.5.2.2 微小體：較斷片小而呈圓形。
5.5.2.3 有着絲點環：帶有着絲點部分，兩端形成環狀結構並伴有一雙無着絲點斷片。
5.5.2.4 無着絲點環：成環狀結構。
5.5.2.5 單體互換：形成三輻體、四輻體或多種形狀的圖像。
5.5.2.6 雙微小體：成對的染色質小體。
5.5.2.8 非特定性型變化：如粉碎化、着絲點細長化、黏着等。
8 6 數據處理和結果評價
8.1 6.1 數據處理
每隻實驗動物作爲一個觀察單位，每組動物按性別分別計算染色體結構畸變細胞百分率。若雌、雄動物之間無明顯的性別差異，可合併計算結果。可用X2檢驗方法進行統計學分析。裂隙應單獨記錄和報告，但一般不計人總的畸變率。
8.2 6.2 結果評價
結果評價時應從生物學意義和統計學意義兩個方面進行分析。劑量組染色體畸變率與陰性對照組相比，具有統計學意義，並呈劑量反應關係或一個劑量組出現染色體畸變細胞數明顯增高並具有統計學意義，並經重複試驗證實，即可確認爲陽性結果。若有統計學意義，但無劑量反應關係時，則應進行重複試驗。結果能重複者可確定爲陽性。
9 7 試驗報告
7.1 試驗名稱、試驗單位名稱和聯繫方式、報告編號。
7.2 試驗委託單位名稱和聯繫方式、樣品受理日期。
7.3 試驗開始和結束日期、試驗項目負責人、試驗單位技術負責人或授權簽字人、簽發日期。
7.4 試驗摘要。
7.5 受試物：名稱、批號、劑型、性狀（包括感官、性狀、包裝完整性、標識）、數量、前處理方法、溶媒。
7.6 實驗動物：物種、品系、級別、數量、體重、性別、來源（供應商名稱、實驗動物生產許可證號），動物檢疫、適應情況，飼養環境（溫度、相對溼度、實驗動物設施使用許可證號），飼料來源（供應商名稱、實驗動物飼料生產許可證號）。
7.7 試驗方法：分組、每組動物數、劑量選擇依據、受試物給予途徑及期限、觀察指標、統計學方法。
7.8 試驗結果：以文字描述和表格逐項進行彙總，包括觀察和分析的細胞數、染色體畸變類型和數量及畸變率，給出數據的統計處理結果。
7.9 試驗結論：給出明確結論。