3 基本信息
ICS 11.020
C 59
中華人民共和國衛生行業標準WS 295—2019《流行性腦脊髓膜炎診斷》（Diagnosis for meningococcal meningitis）由中華人民共和國國家衛生健康委員會於2019年01月02日發佈，自2019年07月01日《關於發佈〈淋病診斷〉等4項強制性衛生行業標準的通告》（國衛通〔2019〕1號）起實施。本標準代替 WS 295—2008。
4 發佈通知
國衛通〔2019〕1號
現發佈《淋病診斷》等4項強制性衛生行業標準，編號和名稱如下：
WS 268—2019 淋病診斷（代替WS 268—2007 ）
WS 269—2019 布魯氏菌病診斷（代替WS 269—2007 ）
WS 293—2019 艾滋病和艾滋病病毒感染診斷（代替WS 293—2008 ）
WS 295—2019 流行性腦脊髓膜炎診斷（代替WS 295—2008）
上述標準自2019年7月1日起施行,WS 268—2007、WS 269—2007、WS 293—2008、WS 295—2008 同時廢止。
特此通告。
國家衛生健康委員會
2019年1月2日
5 前言
本標準的5.1、5.2、5.3爲強制性條款，其餘爲推薦性條款。
本標準按照GB/T 1.1—2009 給出的規則起草。
本標準代替WS 295—2008《流行性腦脊髓膜炎診斷標準》。
本標準與WS 295—2008相比，主要技術變化如下：
——增加了縮略語（見第 2 章）；
——修改了流行病學史（見 3.1，2008 年版的 2.1）；
——修改了臨牀表現（見 3.2,2008 年版的 2.2）；
——修改了“末梢血象”爲“血常規”（見 3.3.1，2008 年版的 2.3.1）；
——增加了腦脊液檢查的結果（見 3.3.2）；
——增加了“瘀點（斑）組織液”（見 3.3.3.2 和 3.3.3.3）；
——修改了診斷原則（見 4，2008 年版的 3）；
——修改了“血清學”爲“免疫學”（見 3.3.4，2008 年版的 2.3.4）；
——修改了疑似病例（見 5.1，2008 年版的 4.2）；
——修改了臨牀診斷病例（見 5.2，2008 年版的 4.3）；
——修改了確診病例（見 5.3，2008 年版的 4.4）；
——增加了“其他腦膜炎球菌性疾病”（見 7.2）；
——增加了“鑑別診斷”（見附錄 B 的 B.4）；
——根據流行性腦脊髓膜炎流行病學特徵的變化，在附錄 B 中，對流行性腦脊髓膜炎的病原學、流行病學和臨牀表現中的有關描述予以訂正（見附錄 B）。
本標準起草單位：中國疾病預防控制中心、首都醫科大學附屬北京地壇醫院、山東省疾病預防控制中心、甘肅省疾病預防控制中心、山東大學齊魯兒童醫院、首都醫科大學附屬北京兒童醫院、中國醫學科學院北京協和醫院。
本標準主要起草人：李藝星、崔富強、邵祝軍、李軍宏、李興旺、徐愛強、蔣榮猛、朱兵清、李慧、蓋中濤、申昆玲、吳丹、範洪偉。
本標準所替代標準的歷次版本發佈情況爲：
——WS 295—2008。
6 標準正文
流行性腦脊髓膜炎診斷
6.1 1 範圍
本標準規定了流行性腦脊髓膜炎的診斷依據、診斷原則、診斷和鑑別診斷。
本標準適用於全國各級各類醫療衛生機構及其醫務人員對流行性腦脊髓膜炎的診斷。
6.2 2 縮略語
下列縮略語適用於本文件。
CFU/mL ：每毫升菌落形成單位（colony-forming unit/mL）
DIC：彌散性血管內凝血（disseminated or diffuse intravascular coagulation）
DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）
ELISA：酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay）
IgG：免疫球蛋白G (immunoglobulin G)
OD：光密度（optical density）
PBS：磷酸鹽緩衝液（phosphate buffer saline）
Real-time PCR ：實時熒光聚合酶鏈式反應(real-time polymerase chain reaction)
SBA：血清殺菌力試驗(serum bactericidal assays)
TTC：氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride)
rpm：每分鐘轉數（revolutions per minute）
WHO：世界衛生組織(world health organization)
6.3 3 診斷依據
6.3.1 3.1 流行病學史
當地有本病發生或流行，或發病前10 d內有流行性腦脊髓膜炎流行地區居住或旅行史。
6.3.2 3.2 臨牀表現
3.2.1 潛伏期
數小時至 10 d，一般爲 2 d～3 d。
3.2.2 主要臨牀症狀和體徵
3.2.2.1 發熱、頭痛、嘔吐，和（或）有腦膜刺激徵，嬰幼兒可見前囟隆起。重症患者可有不同程度的意識障礙和（或）感染中毒性休克。
3.2.2.2 皮膚、黏膜出現瘀點（斑）。瘀斑可迅速擴大融合成片。
6.3.3 3.3 實驗室檢測
6.3.3.1 3.3.1 血常規
6.3.3.2 3.3.2 腦脊液常規
典型改變爲壓力增高，外觀呈渾濁米湯樣或膿樣；白細胞數明顯增高，並以多形核白細胞增高爲主；糖及氯化物明顯減少，蛋白含量升高。但在病程初期僅有壓力升高，外觀清亮，隨後出現典型改變，暴發休克型患者腦脊液通常清亮，蛋白、細胞數和糖亦無變化。
6.3.3.3 3.3.3 病原學
3.3.3.1 瘀點（斑）組織液、腦脊液塗片檢測，可在多形核白細胞內或細胞外見到革蘭陰性腎形雙球菌。
3.3.3.2 腦脊液、血液、瘀點（斑）組織液培養腦膜炎奈瑟菌陽性。
3.3.3.3 腦脊液、血液、瘀點（斑）組織液腦膜炎奈瑟菌特異性核酸檢測陽性。
6.3.3.4 3.3.4 免疫學
3.3.4.1 急性期腦脊液樣品腦膜炎奈瑟菌特異性多糖抗原檢測陽性。
3.3.4.2 恢復期血清腦膜炎奈瑟菌特異性 IgG 抗體檢測，其效價較急性期呈 4 倍或 4 倍以上升高。
6.4 4 診斷原則
根據流行病學史和臨牀表現及血常規和(或)腦脊液常規檢測結果做出疑似病例和（或）臨牀診斷病例的診斷。
確診需要腦膜炎奈瑟菌病原學或免疫學檢測結果，對病原學檢測陽性的病例進一步做出病原學分羣診斷（見附錄 A 的 A.3）。
6.5 5 診斷
6.5.1 5.1 疑似病例
同時符合3.1和3.2.2.1，並同時符合3.3.1、3.3.2任一項。
6.5.2 5.2 臨牀診斷病例
符合5.1並同時符合3.2.2.2。
6.5.3 5.3 確診病例
符合5.1或5.2，並同時符合3.3.3、3.3.4中任一項。
6.5.4 5.4 臨牀分型
在臨牀診斷或確定診斷基礎上，進行臨牀分型診斷（參見附錄B的B.3）。
6.6 6 鑑別診斷
主要和其他細菌所致的腦膜炎、其他原因所致的膿毒症、各種原因引起的紫癜等疾病鑑別。嬰幼兒還應與高熱驚厥等疾病鑑別（參見附錄B的B.4）。
6.7 7 其他
6.7.1 7.1 帶菌者
無臨牀症狀和體徵，咽拭子培養腦膜炎奈瑟菌陽性或腦膜炎奈瑟菌特異性核酸檢測陽性。
6.7.2 7.2 其他腦膜炎球菌性疾病
人感染腦膜炎奈瑟菌後，大部分爲無症狀帶菌者。出現症狀者，臨牀疾病譜複雜多樣，除可引起腦脊髓膜炎外，還可引起膿毒症、肺炎，偶也可引發關節炎、心肌炎、心包炎和眼內炎等疾病。
7 附錄A（規範性附錄）腦膜炎奈瑟菌實驗室檢測方法
7.1 A.1 樣品採集、處理和運送
7.1.1 A.1.1 樣品採集和處理
7.1.1.1 A.1.1.1 腦脊液
無菌操作採集腦脊液至少2 mL，採集後立即送往微生物學實驗室。如有條件，建議牀旁接種，將適量腦脊液（0.1 mL～0.5 mL）接種於5％羊血巧克力平板(以下簡稱巧克力平板)或血平板，三區劃線後送至實驗室進行培養。
實驗室收到腦脊液樣品後，應在1 h內進行檢測。首先將樣品放入無菌試管，2 000 rpm～3 000rpm，離心20 min，吸出上清液。上清液可用於腦膜炎奈瑟菌特異抗原檢測，亦可將其置於-20℃，進行其他檢測。沉澱物部分應進行充分振盪混勻，用於培養及鏡檢。如腦脊液樣品不足1 mL，則不進行離心，直接進行平板接種培養和革蘭染色鏡檢。
7.1.1.2 A.1.1.2 血液
如需開展核酸檢測（如Real-time PCR檢測），在離心之前無菌操作留取腦脊液樣品200 µL，-20℃以下保存。無菌採集患者急性期靜脈血液5 mL～10 mL，立即送往微生物學實驗室進行處理和檢測。建議牀旁接種，將適量的血液（5 mL～10 mL）立即注入血培養瓶內，或將0.5 mL血液直接接種於巧克力平板或血平板。剩餘血液樣品用於腦膜炎奈瑟菌特異性核酸檢測或IgG抗體檢測。採集患者發病急性期和恢復期雙份血液樣品，分離血清，檢測腦膜炎奈瑟菌特異性IgG抗體。採集血液樣品過程中應不使用抗凝劑。
建議在抗感染治療之前，同時在不同部位各採集1份，共2份血液樣品進行培養。新生兒採集1份血液樣品。
7.1.1.3 A.1.1.3 瘀點或瘀斑
選取患者皮膚上的新鮮瘀點或瘀斑，先用碘伏消毒，再用70％的酒精擦除碘伏，待酒精完全揮發後用無菌針頭挑破，擠出組織液，用消毒後的玻片直接蘸取組織液塗片，革蘭染色鏡檢；隨後用無菌棉籤蘸取組織液接種於巧克力平板或血平板，三區劃線後送至實驗室進行培養。
7.1.2 A.1.2 樣品的運送
腦膜炎奈瑟菌對溫度較爲敏感，避免樣品暴露於陽光、高溫或寒冷的環境，溫度過低或過高均可導致病原菌死亡。在運送樣品或培養物時，應保持樣品處於25℃～35℃之間，不能低溫運送（用於檢測抗體和核酸的樣品除外）。
7.2 A.2 腦膜炎奈瑟菌培養及鏡檢
7.2.1 A.2.1 腦脊液樣品培養
用滅菌的毛細管或微量移液器吸頭吸取沉澱物直接接種於巧克力平板和（或）血平板，三區劃線。5％ CO2環境，37℃，培養24 h～72 h，每日檢查細菌生長情況，及時對平板上的疑似菌落進行轉種和鑑定。
7.2.2 A.2.2 腦脊液樣品鏡檢
吸取腦脊液樣品離心後的沉澱物10 µL～20 µL，滴於載玻片上並塗開，在生物安全櫃中風幹玻片並快速通過火焰3次以固定塗片，注意避免灼幹。結晶紫染色1 min，用流動水沖洗玻片1 min，去除多餘水分；革蘭碘液媒染1 min，用流動水沖洗玻片並乾燥；95％乙醇脫色5 s～10 s；用番紅染液復染20s～30 s，或用酚紅復染10 s～15 s，流動水沖洗玻片並晾乾或蘸幹。顯微鏡觀察染色的塗片，在亮視野的透鏡和油鏡下，腦膜炎奈瑟菌位於多形核白細胞內或細胞外，爲革蘭陰性、腎形雙球菌。
7.2.3 A.2.3 血液樣品分離培養
實驗室接收到已接種血液樣品的平板或血培養瓶後應立即置於37℃、5％ CO2的環境中，培養24 h～72 h。如使用血培養瓶，每日觀察細菌生長情況，如發現細菌生長，無菌操作取0.5 mL接種於巧克力平板和（或）血平板。
7.2.4 A.2.4 腦膜炎奈瑟菌菌落形態
腦膜炎奈瑟菌可在血平板或巧克力平板上生長。在血平板上培養18 h～20 h後，可見圓形、光滑、溼潤、中央凸起、邊界清晰、灰色的菌落，不溶血，菌落直徑達1 mm。在巧克力平板上生長的菌落呈現大菌落、無色或灰色、不透明。
7.2.5 A.2.5 腦膜炎奈瑟菌生化特徵
採用氧化酶試驗和糖代謝試驗進行腦膜炎奈瑟菌的鑑定。如果氧化酶試驗陽性，再進行糖代謝試驗。腦膜炎奈瑟菌能氧化葡萄糖和麥芽糖，但不氧化乳糖和蔗糖。
7.3 A.3 腦膜炎奈瑟菌血清學分羣
7.3.1 A.3.1 試驗方法
通過血清玻片凝集法可對腦膜炎奈瑟菌進行血清羣鑑定，目前腦膜炎奈瑟菌已經確定了12個不同的血清羣，其中，A、B、C、W、X和Y是最常見的引起流行性腦脊髓膜炎的6種血清羣。
7.3.2 A.3.2 實驗操作
用乙醇擦淨一塊載玻片，用蠟筆或其它記號筆將載玻片分爲多個部分，在每個部分的近底部處加10 µL滅菌生理鹽水，用無菌接種環或針、塗棒或牙籤從巧克力平板或血平板上挑取適量細菌培養物，在生理鹽水中將培養物製成略呈乳液狀的懸液用於測試。在每個部分的上部加上所選的血清10 µL或10µL生理鹽水或PBS。在亮光下或黑色背景下，將血清或生理鹽水與各自的菌懸液混合，搖動玻片1min～2 min（時間可能因血清生產商不同而有所差異）。
鑑於生物安全，WHO推薦使用福爾馬林滅活的腦膜炎奈瑟菌懸液，而不是活菌的生理鹽水懸液。福爾馬林是一種致癌物，在儲存和使用時應高度小心，操作應在生物安全櫃中進行。
7.3.3 A.3.3 實驗結果的讀取
血清可分羣的腦膜炎奈瑟菌應只與一種分羣血清凝集，與生理鹽水或PBS不發生凝集。如果在生理鹽水或PBS中凝集，說明腦膜炎奈瑟菌有自凝性，判爲自凝菌；如果無自凝現象，但與兩種或兩種以上血清發生凝集，判爲多凝菌；與任何一種血清或生理鹽水或PBS都不能發生凝集，判爲不凝菌；以上三種情況均可報告爲“血清不可分羣腦膜炎奈瑟菌”。
7.4 A.4 流行性腦脊髓膜炎Real-time PCR診斷
7.4.1 A.4.1 種特異性 Real-time PCR檢測
7.4.1.1 A.4.1.1 ctrA基因檢測
絕大部分腦膜炎奈瑟菌含有ctrA基因（莢膜轉運基因），少數菌株會缺失ctrA基因成不可分羣菌株。腦膜炎奈瑟菌侵襲性病例多由有莢膜的菌株感染引起，檢測腦脊液、血液等無菌部位樣品時，可採用ctrA基因作爲靶基因進行Real-time PCR檢測。ctrA基因Real-time PCR引物和探針序列如下：
ctrA-F：5′-TGTGTTCCGCTATACGCCATT-3′
ctrA-R：5′-GCCATATTCACACGATATACC-3′
ctrA-Pb：5′-(FAM)AACCTTGAGCAA"T"CCATTTATCCTGACGTTCT (SpC6) -3′
“T”標記淬滅基團BHQ1。
7.4.1.2 A.4.1.2 sodC基因檢測
腦膜炎奈瑟菌均含有sodC基因（銅-鋅超氧化物歧化酶基因），其他種屬細菌，如嗜血桿菌等也含有sodC基因。如果考慮不可分羣腦膜炎奈瑟菌也可偶然引起疾病，可檢測sodC基因，其引物和探針序列如下：
sodC-F：5′-GCACACTTAGGTGATTTACCTGCAT-3′
sodC-R：5′-CCACCCGTGTGGATCATAATAGA-3′
sodC-Pb：5′-(FAM)CATGATGGCACAGCAACAAATCCTGTTT(BHQ1)-3′
7.4.2 A.4.2 血清羣特異性Real-time PCR檢測
ctrA或sodC基因陽性的樣品，可判斷爲腦膜炎奈瑟菌感染，需進行血清羣特異性基因檢測，以確定腦膜炎奈瑟菌血清羣。相應引物和探針序列見表A.1：
表 A.1 腦膜炎奈瑟菌血清羣鑑定 Real-time PCR 引物和探針序列
7.4.3 A.4.3 臨牀樣品DNA處理
採用市售的DNA提取試劑盒，提取腦脊液、血液、瘀點（斑）組織液等臨牀樣品中腦膜炎奈瑟菌的DNA，不推薦採用直接煮沸方法。根據臨牀樣品的類型、數量，以及其他革蘭陽性菌感染的可能性，在提取臨牀樣品DNA前期處理時，建議加入溶菌酶和變溶菌素。
7.4.4 A.4.4 Real-time PCR反應體系和反應條件
PCR反應體系以20 µL爲例，2×PCR反應混合物10 µL，上下游引物、探針各2 µL（ctrA上下游引物和探針終濃度分別爲0.9 µmol/L、0.9 µmol/L、0.1 µmol/L，sodC上下游引物和探針終濃度分別爲0.3µmol/L、0.6 µmol/L、0.1 µmol/L，分羣引物和探針終濃度分別爲0.6 µmol/L、0.6 µmol/L、0.1µmol/L），根據熒光PCR儀的要求確定是否加入參比熒光 Rox 及加入量，DNA模板2 µL，超純水補齊至20 µL。反應條件：退火溫度60℃，共50個循環；其他反應條件根據所使用的2×PCR反應混合物的介紹進行調整。
7.4.5 A.4.5 Real-time PCR 檢測結果的判斷
擴增圖應呈光滑的S型曲線，如果曲線的形狀改變，應判斷爲陰性或者重新檢測。手動拖拽閾值線至基線上方後讀取Ct值，根據以下標準判斷檢測結果。
“陽性”：Ct 值≤36；“陰性”：Ct 值≥40；“可疑”：Ct 值介於36～40Ct 值介於36～40，結果爲可疑，應重新檢測。重新檢測時可採取以下兩種方法：
a) 將模板稀釋 4～10 倍和用 4 µL 模板代替 2 µL 兩種方法重複檢測。如果 Ct 值≤36，該樣品判斷爲陽性，否則爲陰性。
b) 同時設置三個平行孔檢測，如果兩個或三個孔出現良好的擴增曲線，判斷爲陽性，否則爲陰性。
7.5 A.5 採用PCR輔助鑑定疑似菌株
7.5.1 A.5.1 種特異性鑑定
crgA基因存在於所有腦膜炎奈瑟菌中，曾作爲靶基因用於腦膜炎奈瑟菌種特異性鑑定。但由於部分乳糖奈瑟菌也存在與腦膜炎奈瑟菌高度同源的crgA基因，建議結合crgA基因和sodC基因的檢測結果進行判定，兩個基因檢測結果同時陽性時可判定爲腦膜炎奈瑟菌。crgA和sodC引物序列見表A.2：
7.5.2 A.5.2 腦膜炎奈瑟菌分羣鑑定
對明確鑑定爲腦膜炎奈瑟菌的菌株可採用普通PCR方法進行分羣鑑定，相應引物序列見表A.3：
7.5.3 A.5.3 樣品處理
可採用目前市售的DNA提取試劑盒提取菌株DNA。也可採取直接煮沸方法，用適量滅菌蒸餾水製備菌懸液，沸水浴10 min，12 000 rpm 離心5 min，取上清液作爲PCR擴增模板。
7.5.4 A.5.4 PCR擴增及產物檢測
94℃預變性5 min；94℃ 30 s，55℃～60℃ 30 s，72℃ 40 s，30個循環；72℃終末延伸5 min。反應產物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓5 V/cm。
7.6 A.6 膠乳凝集試驗
7.6.1 A.6.1 樣品的處理和檢測
應嚴格按照試劑盒介紹操作。爲了獲得最佳的結果，腦脊液樣品的上清液應儘快檢測；如果樣品不能立即檢測，應於2℃～8℃短期（4 h～6 h）冷藏，或-20℃以下長期凍存。乳膠試劑置於2℃～8℃保存，不能凍存。
乳膠凝集試驗檢測腦脊液樣品的步驟應遵循試劑盒推薦方法。一般步驟如下：
a) 1 000 ×g 離心腦脊液樣品 10 min～15 min，收集上清液，沉澱用於革蘭染色和培養。
b) 上清液 100℃，加熱 3 min。
c) 混勻乳膠凝集試劑。
d) 滴 1 滴乳膠試劑在卡片上或者玻片上。
e) 在乳膠液中加入 30 µL～50 µL 上清液。
f) 最好在震盪器上慢速（100 rpm）搖動；如無條件，手動搖晃 2 min～10 min。
注：混勻時儘量避免交叉污染。
g) 在明亮處觀察凝集試驗的結果。
7.6.2 A.6.2 結果判斷
陽性結果：在2 min～10 min內乳膠顆粒凝集（或可見團塊）。
7.7 A.7 酶聯免疫吸附試驗 (ELISA)
ELISA法可檢測患者急性期和恢復期血清特異性IgG抗體水平。嚴格遵照試劑盒的操作說明進行檢測。
7.8 A.8 血清殺菌力試驗（SBA）
7.8.1 A.8.1 靶菌
作爲靶菌的腦膜炎奈瑟菌對補體的自然殺菌作用應具有耐受性，但對殺菌抗體反應敏感。
7.8.2 A.8.2 稀釋液製備
滅菌磷酸鹽緩衝液（DPBS）：含0.5 mmol/L MgCl2，0.9 mmol/L CaCl2；pH 7.4。配製的稀釋液分裝於小瓶中，置於4℃，備用2周。使用前每100 mL稀釋液加滅菌10%葡萄糖1 mL。
7.8.3 A.8.3 滴定板、補體及瓊脂選擇
滴定板選擇96孔“U”型底或“平”底細胞培養板。補體一般採用3周～4周幼齡兔血清，要求無自然殺傷靶菌活性，但加入已知陽性參考血清時應產生較高殺菌抗體滴度。瓊脂使用氯化三苯基四氮唑瓊脂培養基（TTC瓊脂）。
7.8.4 A.8.4 陽性參考血清製備
用腦膜炎奈瑟菌免疫兔製備的診斷血清，不加防腐劑，經預試驗測定其殺菌抗體滴度較高（1:3200以上）；或用人抗腦膜炎奈瑟菌參考品血清CDC1992。
7.8.5 A.8.5 殺菌抗體測定步驟
7.8.5.1 A.8.5.1 靶菌液的製備
將A、B、C、W和Y羣等腦膜炎奈瑟菌純培養物製成輕度混濁的均勻菌懸液，600 nm波長下測量OD值爲0.35左右，菌液的最終濃度爲4 000 CFU/mL。稀釋的靶菌懸液在1 h內用完。若室溫較高，可將菌液管置冰中，以防靶菌迅速死亡。
7.8.5.2 A.8.5.2 殺菌抗體的測定
待檢血清樣品置於56℃，30 min滅活補體，滴定板每孔內加25 µL稀釋液，每排第一孔內加25 µL滅活的待檢血清，用移液器從第一孔吹吸5次～10次，吸出25 µL至下一孔，如此做連續倍比稀釋至最後一孔。從低溫冰箱內取出補體，於低於10℃的水中搖動將其速溶，每孔加25 µL等體積混合的補體靶菌混合液（補體和菌懸液各12.5 µL）。滴定板置微型振盪器上中速振盪5 min，37℃，無CO2環境，培養60 min～90 min，取出後每孔加50 µL已融化並冷卻至45℃左右的TTC瓊脂，邊振盪邊加TTC瓊脂。將滴定板置5％ CO2環境，37℃培養15 h～20 h後觀察結果。
7.8.5.3 A.5.8.3 實驗對照
陽性質控血清對照（稀釋液12.5 µL、陽性質控血清12.5 µL、活補體12.5 µL和菌液12.5 µL）；補體對照(稀釋液25 µL、活補體12.5 µL和菌液12.5 µL，檢查補體自然殺菌活性)；細菌生長對照(稀釋液25 µL、滅活補體12.5 µL和菌液12.5 µL)；被檢血清對照（被檢血清25 µL、滅活補體12.5 µL和菌液12.5µL，檢查被檢血清自然殺菌活性）。每批次檢測中應有一組上述四種對照試驗。菌落計數：取菌液12.5µL，滴加到一個巧克力瓊脂平皿的一端，沿着劃好的兩條線傾斜往下流，在37℃，5％ CO2環境，與滴定板同時培養，次日檢查每滴靶菌的純度並記錄菌落數，平板上生長的菌落數每12.5 µL應爲50 CFU～60 CFU。
7.8.5.4 A.5.8.4 結果判斷
檢查上述四種對照試驗的結果，補體對照、抗體對照和細菌生長對照的各孔應出現衆多的紅色點狀小菌落；陽性參考血清應達到原來確定的殺菌滴度。以補體對照爲參照計算殺菌率，殺菌率爲50％的血清稀釋度即爲特異性體外殺菌滴度，即若所試各孔中紅色點狀菌落數目明顯少於補體對照孔50％以下或不出現紅色點狀菌落時，則判斷爲殺菌陽性；如果所測試孔中的菌落數目接近補體對照孔的一半以上或更多時，則判斷爲殺菌陰性。出現殺菌陽性的血清最高稀釋度爲殺菌抗體的最高滴度。SBA可用於測定患者急性期和恢復期血清中殺菌抗體水平，也可用於健康人羣血清殺菌抗體檢測。
8 附錄B（資料性附錄）病原學、流行病學、臨牀分型和鑑別診斷
8.1 B.1 病原學
8.1.1 B.1.1 腦膜炎奈瑟菌
流行性腦脊髓膜炎的病原菌爲腦膜炎奈瑟菌，俗稱腦膜炎雙球菌，爲腎形或豆形革蘭陰性雙球菌。在患者腦脊液中，多位於多形核白細胞內或細胞外，形態典型。新分離的菌株大多帶有莢膜和菌毛，人工培養後可成卵圓形或球形，排列不規則。
腦膜炎奈瑟菌的主要致病成分爲內毒素，內毒素作用於小血管和毛細血管，引起壞死、出血，出現皮膚瘀點（斑）和微循環障礙，嚴重膿毒症時，大量內毒素釋放可造成彌散性血管內凝血（DIC）及中毒性休克。
8.1.2 B.1.2 血清分羣
根據莢膜多糖的結構，腦膜炎奈瑟菌可分爲A、B、C、X、Y、Z、E、W、L、H、I、K等12個血清羣。
8.1.3 B.1.3 生物特性
腦膜炎奈瑟菌對環境的抵抗力低，對寒冷、乾燥、高溫、日光及紫外線都很敏感。化學藥劑，如1％酚、0.1％昇汞、0.1％新潔爾滅、0.01％杜滅芬、75％酒精等處理很快死亡。腦膜炎奈瑟菌能產生自溶酶，在保護劑中（如卵黃鹽水和脫脂奶），特別是傳代菌株放置冷暗處，自溶酶活力受到抑制，可延長保存時間，在培養基或保護劑中置4℃～6℃，最長可存活2個月。
8.2 B.2 流行病學
8.2.1 B.2.1 傳染源
8.2.2 B.2.2 傳播途徑
病原菌主要通過咳嗽、噴嚏、說話等由飛沫傳播，進入呼吸道引起感染。密切接觸對2歲以下嬰幼兒的傳播有重要意義。
8.2.3 B.2.3 人羣易感性
人羣普遍易感。發病年齡多從2月齡～3月齡開始，6月齡至2歲時發病率最高，以後隨着年齡的增長而逐漸降低。易感人羣受腦膜炎奈瑟菌感染後，60％～70％成爲無症狀帶菌者，25％表現爲皮膚瘀點，7％表現爲上呼吸道感染，僅1％表現爲化膿性腦膜炎。
8.2.4 B.2.4 流行特徵
8.2.4.1.1 B.2.4.1 地區分佈
全球均有流行性腦脊髓膜炎病例發生。A羣腦膜炎奈瑟菌曾引起全球大流行。目前歐美地區流行的血清羣主要爲B羣、C羣或Y羣，W羣則爲非洲流行性腦脊髓膜炎主要流行血清羣。歷史上我國流行性腦脊髓膜炎的流行血清羣以A羣爲主，自2003年以來C羣流行性腦脊髓膜炎逐漸流行。自2010年以來A羣流行性腦脊髓膜炎病例明顯減少，而出現B羣及W羣流行性腦脊髓膜炎病例的地區呈增多的趨勢，個別省份出現X羣和Y羣流行性腦脊髓膜炎病例。
8.2.4.1.2 B.2.4.2 週期性
在腦膜炎球菌疫苗廣泛應用以前，約3年～5年出現一次小流行，8年～10年出現一次較大流行。廣泛接種腦膜炎球菌疫苗，可持續保持較低的流行性腦脊髓膜炎發病水平，流行高峯不再明顯。
8.2.4.1.3 B.2.4.3 季節分佈
8.3 B.3 臨牀分型
8.3.1 B.3.1 普通型
8.3.1.1 B.3.1.1 上呼吸道感染期
有發熱、咽痛、鼻炎和咳嗽等上呼吸道感染症狀。部分病人有此期表現。
8.3.1.2 B.3.1.2 膿毒症期
有惡寒、高熱、頭痛、嘔吐、乏力、肌肉痠痛、神志淡漠等症狀。約70％患者皮膚及黏膜出現瘀點（斑）。
8.3.1.3 B.3.1.3 腦膜炎期
多與膿毒症期症狀同時出現。發病後24 h，除高熱及毒血癥外，主要表現爲劇烈頭痛、嘔吐，可呈噴射性，煩躁不安，腦膜刺激徵陽性。顱壓增高明顯者有血壓升高、脈搏減慢等。嚴重者可進入譫妄、昏迷。嬰幼兒的症狀多不典型，表現爲高熱、拒食、煩躁、啼哭不安，驚厥、腹瀉及咳嗽較成人多見。前囟未閉者囟門可有隆起，而腦膜刺激徵可能不明顯。
8.3.1.4 B.3.1.4 恢復期
經治療體溫逐漸下降至正常，意識及精神狀態改善，皮膚瘀點（斑）吸收或結痂癒合。神經系統檢查均恢復正常。約有10％的患者出現口周皰疹。患者一般在1周～3周痊癒。普通型約佔90％。各期不易嚴格區分。
8.3.2 B.3.2 暴發型
8.3.2.1 B.3.2.1 休克型
又稱“暴發型腦膜炎奈瑟菌膿毒症”。起病急驟，寒戰、高熱或體溫不升，嚴重中毒症狀，短時間（12 h內）出現遍及全身的瘀點（斑）,迅速擴大，或繼以瘀斑中央壞死。休克爲重要表現: 面色灰白、脣及指（趾）端紫紺、四肢厥冷、皮膚花斑狀、脈細速、血壓下降；易併發DIC。多無腦膜刺激徵，腦脊液檢查多無異常。
8.3.2.2 B.3.2.2 腦膜腦炎型
除有高熱、頭痛和嘔吐外，可迅速陷入昏迷，頻繁抽搐，錐體束徵陽性,血壓持續升高。球結膜水腫。部分病人出現腦疝(小腦幕切跡疝、枕骨大孔疝)，表現爲雙側瞳孔不等大，對光反應遲鈍或消失，可出現呼吸不規則，快慢深淺不一或驟停，肢體肌張力增強等症狀。
8.3.2.3 B.3.2.3 混合型
同時具備休克型和腦膜腦炎型的臨牀表現，此型最爲兇險，預後差，病死率高。暴發型病情兇險，進展迅速，如不及時治療，發病6 h～24 h內即可危及生命。嬰幼兒病死率可高達50％。
8.3.3 B.3.3 輕型
臨牀表現爲低熱、輕微頭痛、咽痛等上呼吸道感染症狀；皮膚黏膜可有少量細小出血點；亦可有腦膜刺激徵。腦脊液可有輕度炎症改變。
8.4 B.4 鑑別診斷
8.4.1 B.4.1 肺炎鏈球菌腦膜炎
無明顯季節性，散發。多數病人有肺炎、中耳炎、乳突炎、鼻竇炎等感染竈，部分病人繼發於顱腦外傷骨折之後或腦外科術後。皮膚、黏膜出現瘀點（斑）較爲少見。依據腦脊液和血液病原學檢查可確診。
8.4.2 B.4.2 流感嗜血桿菌腦膜炎
無明顯季節性，散發。起病較爲緩慢，病初多有明顯的上呼吸道感染、肺炎或中耳炎症狀。腦膜炎症狀與其他化膿性腦膜炎相似，偶有皮膚、黏膜瘀點。依據腦脊液和血液病原學檢查可確診。
8.4.3 B.4.3 金黃色葡萄球菌腦膜炎
多繼發於皮膚感染或金黃色葡萄球菌膿毒症，常於化膿性感染數日或數週後發病，感染中毒症狀重，可見猩紅熱樣皮疹、化膿性皮炎、肺炎、肺膿腫等表現。依據腦脊液和血液病原學檢查可確診。
8.4.4 B.4.4 大腸埃希菌腦膜炎
多見於新生兒，常由於早產、損傷性分娩和母親感染所致。亦可發生於顱腦外傷或顱腦手術及鼻竇、乳突等竈性感染或手術後。本病易並發腦室腦炎。皮膚、黏膜出現瘀點（斑）少見。依據腦脊液和血液病原學檢查可確診。
8.4.5 B.4.5 新型隱球菌腦膜炎
多數起病緩慢，可呈亞急性。初期症狀不明顯，常有頭痛，可位於前額、雙側顳部、枕後或眼眶後，多爲脹痛或鈍痛，呈間歇性。伴低熱或不發熱。腦脊液細胞數輕、中度增加，以淋巴細胞爲主，早期也可呈現中性粒細胞爲主；蛋白質水平輕、中度增高，葡萄糖和氯化物降低。依據塗片、培養分離、組織病理標本發現有莢膜的酵母菌可確診新型隱球菌感染。
8.4.6 B.4.6 結核性腦膜炎
無季節性。多有結核病史或密切接觸史。起病較緩慢，也有急性起病，病程較長，腦膜刺激徵較明顯，腦實質通常無明顯病變，晚期可有腦實質病變表現。有發熱、盜汗、消瘦等症狀，神經系統症狀出現較晚。皮膚、黏膜不出現瘀點（斑）。腦脊液以單核細胞爲主，蛋白增高，糖和氯化物降低。腦脊液抗酸桿菌塗片及分枝桿菌培養陽性，菌種鑑定爲結核分枝桿菌復合羣可確診，但陽性率較低。腦脊液分枝桿菌核酸檢測陽性有助於快速確定病原學診斷。腦脊液和血液的γ-擾素釋放試驗陽性，可輔助診斷。必要時可X線胸片和眼底檢查，協助鑑別。
8.4.7 B.4.7 流行性乙型腦炎
主要經蚊媒傳播。蚊蟲孳生季節發病。有發熱、頭痛、噴射性嘔吐，發熱2 d～3 d後出現不同程度意識障礙。皮膚、黏膜不出現瘀點（斑）。腦脊液清亮，腦脊液細胞數中度增加，蛋白質輕度增高，糖和氯化物基本正常。依據血清學檢查和病原學檢查可確診。
8.4.8 B.4.8 中毒型細菌性痢疾
高熱，全身中毒症狀嚴重，可有嗜睡、昏迷及抽搐，迅速發生循環和呼吸衰竭。臨牀主要表現爲嚴重毒血癥、休克和（或）中毒性腦病。發病初期腹痛及腹瀉症狀很輕或無，發病24 h內可出現腹瀉及痢疾樣便。作肛拭或生理鹽水灌腸鏡檢便標本，可見大量膿、白細胞。
8.4.9 B.4.9 腎綜合徵出血熱
多有鼠類接觸史，以發熱、出血、腎功能損傷爲主要表現。初期出血現象較輕，表現爲酒醉貌、結膜充血水腫，皮膚上有條索狀出血點，主要見於腋下。血常規出現異常淋巴細胞。尿常規有大量蛋白尿和紅細胞、白細胞。腦膜刺激徵不明顯，腦脊液檢查陰性。漢坦病毒抗體陽性。
8.4.10 B.4.10 嬰幼兒高熱驚厥
是嬰幼兒期（主要發生在出生後6個月至3歲）最常見的驚厥原因（約佔30％）。多發生於急驟高熱開始後12 h內，發作時間短暫，發作停止後神志即可恢復正常。在一次疾病過程中很少發作2次以上。皮膚無瘀點（斑），腦脊液檢查正常。
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