WS 268—2019 淋病診斷

性傳播疾病 衛生標準 診斷標準 中華人民共和國衛生行業標準 皮膚性病科

目錄

心氣虛,則脈細;肺氣虛,則皮寒;肝氣虛,則氣少;腎氣虛,則泄利前後;脾氣虛,則飲食不入。
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1 拼音

W S 2 6 8 — 2 0 1 9 lìn bìng zhěn duàn

2 英文參考

Diagnosis for gonorrhoea

3 基本信息

ICS 11.020

C 59

中華人民共和國衛生行業標準WS 268—2019《淋病診斷》(Diagnosis for gonorrhoea)由中華人民共和國國家衛生健康委員會於2019年01月02日發佈,自2019年07月01日《關於發佈〈淋病診斷〉等4項強制性衛生行業標準的通告》(國衛通〔2019〕1號)起實施。本標準代替WS 268—2007。

4 發佈通知

關於發佈《淋病診斷》等4項強制性衛生行業標準的通告

國衛通〔2019〕1號

現發佈《淋病診斷》等4項強制性衛生行業標準,編號和名稱如下:

WS 268—2019 淋病診斷(代替WS 268—2007 )

WS 269—2019 布魯氏菌病診斷(代替WS 269—2007 )

WS 293—2019 艾滋病和艾滋病病毒感染診斷(代替WS 293—2008 )

WS 295—2019 流行性腦脊髓膜炎診斷(代替WS 295—2008)

上述標準自2019年7月1日起施行,WS 268—2007、WS 269—2007、WS 293—2008、WS 295—2008 同時廢止。

特此通告。

國家衛生健康委員會

2019年1月2日

5 前言

本標準第5章爲強制性條款,其餘爲推薦性條款。

本標準按照GB/T 1.1—2009給出的規則起草。

本標準代替WS 268—2007《淋病診斷標準》。

本標準與WS 268—2007相比,主要技術變化如下:

——增加了術語和定義;

——修改了臨牀表現的描述(見 3.2,2007 年版的 2.2);

——增加了實驗室檢查淋球菌核酸檢測(見 3.3.3);

——修改了疑似病例和確診病例的判定(見第 5 章,2007 年版的第 4 章);

——增加了淋病的鑑別診斷(見第 6 章);

——增加了附錄 B 淋球菌核酸檢測

本標準起草單位:中國醫學科學院北京協和醫院中國醫學科學院皮膚病研究所、首都醫科大學宣武醫院、天津醫科大學總醫院、復旦大學附屬華山醫院

本標準主要起草人:鄭和義、李軍、王千秋、王寶璽、蘇曉紅、連石、劉全忠、徐金華。

本標準所代替標準的歷次版本發佈情況爲:

——WS 268—2007。

6 標準正文

淋病診斷

6.1 1 範圍

本標準規定淋病的診斷依據、診斷原則、診斷和鑑別診斷。

本標準適用於全國各級各類醫療衛生機構及其醫務人員對淋病的診斷。

6.2 2 術語和定義

下列術語和定義適用於本文件。

2.1

淋球菌 gonococcus

淋病奈瑟菌 (Neisseria gonorrhoeae)的簡稱,又稱淋病球菌,是奈瑟(Albert Neisser)於 1879年首先在淋病患者的膿性分泌物塗片中發現,爲革蘭陰性菌,常成對排列,菌體呈腎形或蠶豆形,大小0.6 μm~0.8 μm。在淋球菌培養基孵育後,可形成圓形稍隆起、光滑、半透明的露滴狀菌落淋球菌生化反應分解葡萄糖,產酸不產氣,不分解麥芽糖蔗糖乳糖

2.2

淋病 gonorrhoea

淋球菌感染泌尿生殖系統肛門直腸、 咽部等所致的,以化膿性炎症爲主要特徵的一種性傳播疾病。主要通過性接觸傳播,引起尿道炎宮頸炎直腸炎、咽炎等,如不及時治療可向周圍組織擴散引起相應的併發症和後遺症,甚至通過血行播散引起腦膜炎、心內膜炎等;也可通過母嬰傳播引起新生兒眼炎等。

6.3 3 診斷依據

6.3.1 3.1 流行病學

有不安全性行爲史,或性伴感染史,或多性伴史。新生兒患者的母親有淋病史。

6.3.2 3.2 臨牀表現

6.3.2.1 3.2.1 潛伏期

1 d ~10 d,常爲 3 d~5 d。

6.3.2.2 3.2.2 無合併症淋病

3.2.2.1 男性淋菌性尿道炎最初症狀尿道口癢、有稀薄或黏液膿性分泌物,多數患者 24 h 後症狀加劇,出現尿痛、燒灼感,分泌物增多,爲黏稠的深黃色膿液,可伴有尿頻、尿急。嚴重者可出現龜頭、包皮內板紅腫,有滲出物或糜爛包皮水腫,可併發包皮嵌頓。查體可見尿道口紅腫充血及膿性分泌物。

3.2.2.2 女性症狀比男性輕,部分患者可無明顯症狀。在成年女性淋病主要引起宮頸炎,可同時或單獨有尿道炎,有症狀者常出現白帶增多、發黃,有的伴下腹痛、尿痛、尿頻和尿急。婦科檢查時宮頸充血、紅腫,易接觸出血,宮頸口有黏液膿性分泌物。女童患者表現爲瀰漫性陰道炎繼發外陰炎,可見陰道口、尿道口、會陰部紅腫,病變部位可出現糜爛潰瘍疼痛陰道有膿性分泌物,排尿困難等。

6.3.2.3 3.2.3 有合併症淋病

3.2.3.1 治療不及時部分患者可出現合併症,男性主要爲附睾炎睾丸炎前列腺炎附睾炎睾丸炎發病急,初起時陰囊睾丸有牽引痛,進行性加重,且向腹股溝處擴散,常有發熱、全身不適。檢查可見附睾睾丸腫大、壓痛,病情嚴重時可觸及腫大的精索及腹股溝淋巴結。病變後期可引起附睾結締組織增生、纖維化和輸精管閉鎖,引起不育前列腺炎表現爲發熱、尿痛、尿頻、尿急,有排尿不盡感和會陰脹痛前列腺肛檢有明顯壓痛和腫大。前列腺分泌物中有大量膿細胞卵磷脂小體減少。此外,男性還可併發其他並症如尿道旁腺炎、尿道周圍膿腫、海綿體炎、龜頭炎龜頭包皮炎尿道狹窄等。

3.2.3.2 女性合併症主要爲盆腔炎,包括子宮內膜炎、輸卵管炎、輸卵管卵巢膿腫腹膜炎等。好發於育齡婦女,多數病人有白帶增多,且爲膿性或血性。全身症狀明顯,如畏寒發熱頭痛厭食噁心嘔吐、雙下腹痛檢查可見下腹壓痛、觸痛和肌緊張,尿道、宮頸等處有膿性分泌物。可發展爲輸卵管卵巢膿腫盆腔膿腫,此時可在附件和陰道穹窿處觸及腫物,觸痛明顯,按之有波動感,如果膿腫破裂,則有腹膜炎甚至中毒休克等表現,以後可造成輸卵管粘連、阻塞以至不孕異位妊娠。此外女性還可併發前庭大腺炎,表現爲前庭大腺紅腫、疼痛腺體開口處有膿性分泌物,大陰脣下 1/2 腫脹明顯,還可伴有全身症狀和腹股溝淋巴結腫大。

6.3.2.4 3.2.4 泌尿生殖道外的淋病
6.3.2.4.1 3.2.4.1 淋菌性眼炎

新生兒淋菌性眼炎常爲經患淋病母親產道分娩感染所致,多爲雙側性,一般於生後3 d內出現症狀。成人淋菌性眼炎多爲自我接種感染密切接觸被分泌物污染的物品所致,單側或雙側。臨牀表現爲瞼結膜充血水腫,有較大量膿性分泌物,治療不及時角膜可失去光澤,繼而潰瘍,甚至發生穿孔及全眼球炎,最後可導致失明

6.3.2.4.2 3.2.4.2 淋菌性咽炎

主要由於口交所致。多數患者症狀症狀輕微,少數可表現爲咽部疼痛灼熱吞嚥困難。查體可見咽黏膜充血扁桃體紅腫,有膿性分泌物附着於咽後壁。

6.3.2.4.3 3.2.4.3 淋菌性直腸

多見於肛交後。多數患者爲無症狀感染,少數表現爲肛門瘙癢、疼痛或墜脹感,排便時加重,有膿性分泌物排出。查體可見直腸黏膜腫脹、充血糜爛、滲血。

6.3.2.5 3.2.5 播散性淋球菌感染

淋球菌通過血行播散至全身,臨牀罕見。表現爲發熱寒戰、皮損、關節疼痛等。皮損初起爲紅色小丘疹、紅斑,繼而出現水皰膿皰關節受累好發於膝、肘、腕等關節,表現爲關節疼痛、局部腫脹、關節腔內積液和關節活動受限,即爲淋菌性關節炎。可發生致命的併發症如淋菌性腦膜炎、心內膜炎、心包炎心肌炎、肝周炎甚至敗血症等。

6.3.3 3.3 實驗室檢查

6.3.3.1 3.3.1 塗片革蘭染色鏡檢

臨牀疑似患者取分泌物,塗片,做革蘭染色鏡檢,可見典型的多形核白細胞內革蘭陰性球菌。有明顯尿道症狀的男性淋菌性尿道炎尿道分泌物標本鏡檢陽性有確診價值。見附錄 A。

6.3.3.2 3.3.2 淋球菌培養

尿道或宮頸分泌物,或其他臨牀標本淋球菌培養,可從臨牀標本分離形態典型、氧化酶試驗陽性菌落。取菌落做塗片檢查,可見革蘭陰性球菌,糖發酵試驗分解葡萄糖,不分解其他糖。

6.3.3.3 3.3.3 淋球菌核酸檢測

尿液尿道或宮頸分泌物標本淋球菌核酸檢測陽性,見附錄 B。

6.4 4 診斷原則

依據流行病學史、臨牀表現及實驗室檢查進行綜合分析,做出診斷。

6.5 5 診斷

6.5.1 5.1 疑似病例

男性淋菌性尿道炎病例符合3.1和3.2;其他病例符合3.1、3.2和3.3.1。

6.5.2 5.2 確診病例

男性淋菌性尿道炎病例符合3.1和3.2,同時符合3.3中任一項;其他病例符合3.1和3.2,同時符合3.3.2或3.3.3。

6.6 6 鑑別診斷

6.6.1 6.1 生殖沙眼衣原體感染

潛伏期長,平均1周~3周,症狀較輕微或無症狀。主要表現爲尿道刺痛或癢感,部分伴有輕重不等的尿頻、尿急、尿痛。尿道口或宮頸充血水腫,可有少量稀薄漿液性或漿液膿性分泌物。沙眼衣原體檢查陽性

6.6.2 6.2 其他

6.6.2.1 6.2.1 非特異性尿道炎

性病無關的細菌尿道炎,如繼發於包莖尿路感染,或繼發於尿道導管插入術和其他尿道器械操作引起的損傷感染。鏡檢常爲革蘭陽性球菌

6.6.2.2 6.2.2 念珠菌性陰道炎

外陰、陰道瘙癢,白帶增多,呈白色凝乳樣或豆腐渣樣,可有異味,大小陰脣潮紅腫脹,陰道黏膜充血水腫,有乳白色薄膜粘附,除去薄膜可見輕度糜爛白膜鏡檢可見大量卵形孢子及假菌絲。

6.6.2.3 6.2.3 滴蟲性陰道炎

外陰瘙癢,有大量黃白色或黃綠色分泌物,呈泡沫狀,有腥臭味,陰道黏膜及宮頸明顯充血並有斑點狀出血,宮頸可呈特徵性草莓狀外觀,分泌物鏡檢可見毛滴蟲。

6.6.2.4 6.2.4 細菌性陰道病

白帶增多,呈灰白色或灰綠色,均勻一致如麪糊狀粘附於陰道壁,有魚腥樣惡臭,pH增高,胺試驗陽性,塗片可見乳酸桿菌減少,革蘭陰性菌增多,有大量橢圓形短桿狀加特納菌,可查見線索細胞

7 附錄A(規範性附錄)淋球菌感染的實驗室診斷方法

7.1 A.1 標本的採集

7.1.1 A.1.1 取材拭子

藻酸鈣拭子、普通棉拭子及滌綸拭子均可採用,但核酸檢測應採用試劑盒配套拭子。

7.1.2 A.1.2 取材部位

淋球菌的易感細胞是柱狀上皮細胞。應根據患者的年齡、性別、性接觸方式、臨牀表現及診斷試驗的方法決定標本採集的適合部位。同一患者行多部位取材可增加檢出陽性率。對男性異性戀患者,一般僅採集尿道標本,有口交史者加取咽部標本;對男男性行爲者應採集尿道直腸及咽部標本;對女性患者常規採集宮頸標本,必要時從尿道直腸、咽部、前庭大腺尿道旁腺取材;對幼女採集陰道分泌物;對播散性淋球菌感染者,除泌尿生殖標本外,還可採集血液關節液或皮損標本。對新生兒眼炎患者採集眼結膜分泌物,對其母親採集宮頸、尿道直腸標本

7.1.3 A.1.3 不同類型標本的採集方法

7.1.3.1 A.1.3.1 尿道拭子

對男性患者,先用生理鹽水清洗尿道口,將男用取材拭子插入尿道內2 cm~3 cm,稍用力轉動,保留5 s~10 s後取出。對女性患者,可用手指自恥骨聯合後沿女性尿道走向輕輕按摩尿道,用同男性相似方法取材。在採集尿道拭子前患者應至少1 h沒有排尿。

7.1.3.2 A.1.3.2 宮頸拭子

取材前用溫水或生理鹽水溼潤擴陰器,應避免使用防腐劑潤滑劑,因爲這些物質對淋球菌生長抑制作用。如果宮頸口外面的分泌物較多,先用無菌棉拭清除過多的分泌物。將女用取材拭子插入宮頸管內1 cm~2 cm,稍用力轉動,保留5 s~10 s後取出。

7.1.3.3 A.1.3.3 直腸拭子

將取材拭子插入肛管內2 cm~3 cm,接觸直腸側壁10 s,避免接觸糞團,從緊靠肛環邊的隱窩中取出分泌物。如果拭子碰到糞團,應更換拭子重新取材。有條件時可在直腸鏡的直視下采集直腸黏液膿性分泌物。

7.1.3.4 A.1.3.4 陰道拭子

青春期前女孩可採集陰道標本。將取材拭子置於陰道穹窿 10 s~15 s,採集陰道分泌物。如果處女膜完整,則從陰道口取材。

7.1.3.5 A.1.3.5 咽拭子

將取材拭子接觸咽後壁和扁桃體隱窩採集分泌物。

7.1.3.6 A.1.3.6 眼結膜拭子

翻開下眼瞼,用取材拭子從下眼結膜表面採集分泌物。

7.1.3.7 A.1.3.7 尿液

在採集尿液標本患者應至少1 h沒有排尿,用無菌、無防腐劑塑料容器收集前段尿液10 mL~20mL。24 h以內檢測尿液,應置於4℃冰箱保存,超過24 h檢測時,應凍存於-20℃或 -70℃冰箱。

7.1.4 A.1.4 標本的運送

淋球菌的抵抗力弱,對熱敏感,不耐乾燥。取材後標本若不能立即接種於分離培養基,需置於運送培養基中。Amies培養基及Stuart培養基爲常用的兩種非營養型運送培養基。置於運送培養基中的標本應在12 h內送到實驗室,接種於選擇性的分離培養基分離陽性率可達90%以上。超過24 h則分離陽性率下降。

7.2 A.2 實驗室診斷方法

7.2.1 A.2.1 革蘭染色鏡檢

7.2.1.1 A.2.1.1 儀器和材料

顯微鏡及革蘭染液。

7.2.1.2 A.2.1.2 革蘭染色方法

A.2.1.2.1 塗片固定:取材後將拭子在玻片上輕輕滾動一下,製成薄而均勻的塗片,自然乾燥後將塗片(塗膜面向上)迅速通過火焰2次~3次,加熱固定。應避免加熱過度使細胞形態扭曲。

A.2.1.2.2 革蘭染色步驟如下:

1) 將結晶紫溶液鋪滿在塗片的塗膜面上,染色 30 s~60 s,流水輕輕沖洗

2) 將碘液鋪滿塗膜面上,染色 30 s~60 s,流水輕輕沖洗

3) 用乙醇丙酮脫色,至塗膜無藍色脫下爲止。一般需 10 s~20 s(時間長短取決於塗片的厚薄,應避免過度脫色),流水輕輕沖洗

4) 用鹼性復紅或沙黃染液復染 60 s,流水沖洗後用吸水紙輕輕吸乾。

A.2.1.2.3 結果觀察:在光學顯微鏡(100倍物鏡或油鏡)下檢查塗片。檢查注意觀察細胞類型(如上皮細胞、多形核白細胞),病原體的染色特性(革蘭陽性陰性)、形狀(球狀或桿狀)及位置(細胞內或細胞外)等。淋球菌爲革蘭陰性菌,常成對排列,菌體呈腎形,二菌長軸平行,接觸面平坦或稍凹,位於多形核白細胞內。

A.2.1.2.4 結果報告:多形核白細胞內見到形態典型的成對的革蘭陰性球菌陽性;多形核白細胞外見到形態典型的革蘭陰性球菌可疑;有或無多形核白細胞但無革蘭陰性球菌陰性(可僅報告多形核白細胞數)。

A.2.1.2.5 臨牀意義:革蘭染色的敏感性和特異性取決於標本的類型。對來自男性淋菌性尿道炎尿道分泌物標本,其敏感性及特異性可高達95%~99%,具有診斷價值。但檢測宮頸標本、無症狀男性尿道拭子及取自直腸標本時,其敏感性僅爲40%~70%, 故應採取分離培養方法鑑定。不推薦用革蘭染色直接顯微鏡檢查診斷直腸和咽部淋球菌感染, 亦不能用於療後判愈。如果在多形核白細胞外見到形態典型的革蘭陰性球菌,需做培養進行確證。

7.2.2 A.2.2 淋球菌分離培養

7.2.2.1 A.2.2.1 培養基

分離淋球菌一般選用營養豐富的選擇性培養基。常用的選擇性培養基有改良的Thayer-Martin (T-M)培養基、含抗生素血液瓊脂巧克力瓊脂培養基。可購買商品化的培養基或實驗室自配培養基密封塑料袋中,於4℃冰箱貯存,貯存時間不應超過3周,時間過久則分離率降低。分述如下:

a) Thayer-Martin(T-M)培養基

1) 成分。包括 GC 基礎培養基血紅蛋白粉,VCNT 抑菌劑(含萬古黴素多粘菌素、三甲氧苄胺嘧啶制黴菌素),Iso-Vitalex 增菌劑。

2) 配製方法。以配製 500 mL 培養基爲例,步驟如下:

稱取 GC 瓊脂粉 18 g,置一燒瓶中,加 235 mL 蒸餾水,搖勻後置沸水浴 15 min~30 min,使瓊脂完全溶解

稱取血紅蛋白粉 5 g,加於乳鉢內,用 250 mL 蒸餾水分次研磨溶解後,置沸水浴 15 min~30 min;

將上述兩種溶液置於 121℃高壓滅菌 15 min,冷卻至 50℃,在無菌條件下將血紅蛋白溶液緩慢加入到瓊脂液內,棄去可能存在的血紅蛋白沉渣;

取 1 小瓶 Iso-Vitalex 增菌劑,用所附的一小瓶稀釋液溶解後加入到步驟 3 所配的混合液中,邊加邊搖;

取一小瓶 VCNT 抑菌劑,用 5 mL 無菌蒸餾水溶解後加入到步驟 4 所配的混合液中,邊加邊搖;

無菌條件下將配好的培養基分裝入無菌平皿中,待凝固後,用塑料袋封存,置 4℃冰箱保存備用。

b) GC 血液瓊脂培養基

1) 成分。包括 GC 基礎培養基和脫纖維羊血

2) 配製方法:以配製 500 mL 培養基爲例,步驟如下:

取 GC 瓊脂粉 18 g,置一燒瓶中,加 450 mL 蒸餾水,搖勻後置沸水浴 15 min~30 min,使瓊脂完全溶解

將 GC 瓊脂溶液置於 121℃高壓滅菌 15 min,冷卻至 50℃;

無菌條件下將 50 mL 脫纖維羊血羊血在臨用前置 37℃水浴預熱)加入到瓊脂溶液中,搖勻後分裝於無菌平皿中,待凝固後,置塑料袋封存,置 4℃冰箱保存備用。

c) Amies 運送培養基

1) 成分。活性炭 5 g,氯化鈉(NaCl)1.5 g,磷酸氫二鈉(Na2HPO4)0.575 g,磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.1 g,氯化鉀(KCl)0.1 g,硫代乙酸鈉 0.5 g,氯化鈣(CaCl)0.05 g,氯化鎂(MgCl)0.05 g,瓊脂 2 g,蒸餾水 500 mL。

2) 配製方法:以配製 500 mL 培養基爲例,步驟如下:

將各種成分加到 500 mL 蒸餾水中,充分混合;

121℃高壓滅菌 15 min,冷卻至 50℃,然後分裝於小管中,每管 6 mL。在分裝時,不時搖動混勻瓊脂,以使活性炭末處於均勻混懸狀態;

置 2℃~8℃可儲存 6 個月。

7.2.2.2 A.2.2.2 接種標本

取材後標本應儘可能及早接種。培養基應先置於室溫中預溫。將取材的拭子轉動塗布於平皿的上1/4範圍,然後用接種環分區劃線,以保證獲得較純的單個菌落

7.2.2.3 A.2.2.3 培養條件

接種標本後,立即將平皿置於(36±1)℃,含5%~10% CO2,溼潤(70%溼度)的環境中培養。淋球菌爲需氧菌,但初代分離需要CO2 。CO2環境可由CO2培養箱、CO2產氣袋或燭缸提供。使用燭缸時,應使用白色、無芳香味的無毒蠟燭。在燭缸底部放些浸水棉球以保持一定的溼度。

7.2.2.4 A.2.2.4 觀察結果

培養24 h後檢查平皿,此時沒有菌生長的平皿應繼續培養至72 h,仍無菌生長纔可丟棄,做出淋球菌養陰性的報告。因爲某些菌株,如AHU-營養型菌株生長緩慢,且菌落小。如果培養時間不足72 h,它們可能會被忽略。對選擇性培養基分離可疑菌落應做進一步鑑定

7.2.2.5 A.2.2.5 淋球菌的初步鑑定

A.2.2.5.1 菌落特徵。選擇性培養基分離出的淋球菌菌落大小形態培養基及培養時間的不同可有差異。一般而言,在TM平皿上生長24 h後直徑大約爲0.5 mm~1 mm,呈圓形、凸起、溼潤、光滑、半透明或灰白色菌落,通常有黏性。培養48 h後菌落直徑可達3 mm,邊緣平滑或呈鋸齒狀,表面粗糙。

A.2.2.5.2 氧化酶試驗。淋球菌具有氧化酶,能將氧化酶試劑氧化成醌類化合物,出現顏色反應鑑定事項如下:

a) 試劑。包括鹽酸四甲基對苯二胺及鹽酸二甲基對苯二胺,前者更敏感,工作液爲 0.5%~1%水溶液

b) 方法。將氧化酶試劑滴加可疑菌落上,觀察顏色變化。也可先將試劑滴在一小張濾紙上,然後白金耳塑料接種環(含鐵接種環可與氧化酶試劑發生反應,產生假陽性)挑取可疑菌落與之接觸;或先將菌落塗在濾紙上,再滴加試劑,觀察有無顏色變化。

c) 結果。在 10 s~15 s 內出現深紫紅色(二甲基對苯二胺)或深紫蘭色(四甲基對苯二胺) 即爲陽性反應

d) 注意事項。氧化酶試劑對細胞毒性,可迅速殺死淋球菌。因此,需保留菌株時應注意不要將試劑滴於全部可疑菌落上,留一部分菌落傳代培養

e) 臨牀意義。淋球菌氧化酶試驗爲陽性,但氧化酶反應並非特異性試驗。所有奈瑟菌屬細菌及許多其他細菌包括多數弧菌、布氏菌屬、綠膿桿菌及嗜血桿菌屬等氧化酶反應亦呈陽性。如氧化酶陰性,一般可排除淋球菌

A.2.2.5.3 革蘭染色。取單個可疑菌落製備塗片做革蘭染色,在油鏡下檢查。24 h的新鮮菌落可見到呈典型腎形的革蘭陰性球菌(約佔25%),其餘呈單球、四聯或八疊形。超過48 h的較老培養物,因細菌自溶,革蘭染色常難以說明問題。

7.2.2.6 A.2.2.6 淋球菌確認鑑定
7.2.2.6.1 A.2.2.6.1 注意事項

對於取自泌尿生殖道的標本,在選擇性培養基分離出氧化酶陽性的革蘭陰性球菌一般可診斷爲淋球菌,準確率98%。但對取自泌尿生殖道以外部位的標本,來自低危人羣如兒童分離株,以及涉及醫療法律案例的分離株,應對培養的菌株經糖發酵試驗進一步鑑定確證。

7.2.2.6.2 A.2.2.6.2 糖發酵試驗

該試驗檢測奈瑟球菌分解特定糖類(葡萄糖麥芽糖乳糖蔗糖)而產酸的能力。根據淋球菌分解葡萄糖腦膜炎球菌分解葡萄糖麥芽糖等可將淋球菌與其他奈瑟球菌加以鑑別。鑑定事項如下:

a) 試劑。配製 20%的葡萄糖麥芽糖乳糖蔗糖過濾除菌。配製緩衝平衡鹽指溶液(BSS):每 1 L 中含磷酸氫二鉀(K2HPO4)0.4 g、磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.1 g、氯化鉀(KCl)8.0 g、酚紅0.6 g、pH 7.1~pH 7.2。過濾除菌,貯於 4℃備用。

b) 方法。WHO 推薦的微量試管法,步驟如下:

1) 取在非選擇性(不含抗生素巧克力瓊脂血液瓊脂培養基上過夜生長純培養淋球菌(2接種環),在 0.4 mL BSS 中製成濃厚菌懸液;

2) 取 5 支小試管,在 1 管~4 管中分別加入 20%過濾除菌的葡萄糖麥芽糖乳糖蔗糖各0.05 mL。第 5 管不加糖,作爲陰性對照管;

3) 每管加入 0.1 mL BSS;

4) 每管加 0.05 mL 菌懸液,充分混勻,置 37℃水浴箱中孵育 4 h,觀察結果。

c) 結果觀察。淋球菌發酵葡萄糖,不發酵其他糖類。僅葡萄糖管顏色由紅變爲黃色,爲淋球菌

d) 注意事項。用於試驗的糖類純度要高,尤其是麥芽糖應爲分析純級。糖發酵試驗中常因雜菌污染導致假陽性反應或培養物過老自溶而導致假陰性反應。因此,待測菌應爲純培養物,不能用選擇性培養基上的初代分離菌(可能含有雜菌)。此外,菌懸液濃度要足夠高。每批試驗應有WHO 或 ATCC 標準菌株做質控。

e) 臨牀意義。選擇性培養基分離出的氧化酶陽性、革蘭陰性的雙球菌,若糖發酵試驗陽性可確定爲淋球菌。糖發酵試驗的特異性爲 99%~100%,某些淋球菌菌株尤其是 AHU-分離反應弱,可呈現陰性葡萄糖反應,需用另外的試驗加以鑑定麥芽糖陰性腦膜炎球菌也會被誤鑑定淋球菌,對泌尿生殖道外的分離株最好採用一種以上的鑑定方法

7.2.3 A.2.3 淋球菌核酸檢測

見附錄B。

8 附錄B(規範性附錄)淋球菌核酸檢測

8.1 B.1 基本情況

目前,經國家批准的檢測淋球菌核酸的試劑盒有DNA和RNA檢測,檢測技術爲PCR-熒光針法熒光PCR。有單獨檢測淋球菌,也有同時檢測沙眼衣原體淋球菌的試劑盒。

8.2 B.2 儀器與材料

8.2.1 B.2.1 儀器

熒光定量PCR儀、高速冷凍離心機、旋渦混合器、加熱儀、移液器等。

8.2.2 B.2.2 材料

試劑盒一般提供包括DNA或RNA提取液、PCR反應液(含引物、探針和酶等)、臨界陽性質控標準品陰性陽性質控品等。

8.3 B.3 檢測步驟

8.3.1 B.3.1 核酸提取(可使用商品化核酸提取試劑盒按說明進行提取):

標本充分洗脫無菌生理鹽水中,離心沉澱;沉澱中加核酸提取液並充分混勻,沸水浴處理,轉至4℃靜置以保證充分裂解離心沉澱,取上清液做PCR反應模板液;質控品處理:取陰、陽性對照質控標準品核酸提取液混勻,提取核酸方法標本

8.3.2 B.3.2 加樣:

根據待檢測樣本數量將PCR反應液分裝至PCR反應管中,然後分別加入已處理好的待檢樣品陰性陽性質控標準品,以及臨界陽性質控標準品,加蓋後離心數秒鐘。

8.3.3 B.3.3 核酸擴增檢測

將各反應管放入實時熒光PCR儀,按對應順序設置陰陽性質控標準品以及未知標本,並設置樣品名稱、標記熒光基團種類和擴增條件。設置擴增參數:依據試劑盒和儀器的不同而有所不同,如95℃變性5min,以95℃ 30s、60℃30s擴增40個循環,在60℃進行熒光檢測

8.3.4 B.3.4 檢驗結果的解釋

B.3.4.1 閾值設定:以閾值線剛好超過正常陰性對照擴增曲線的最高點。

B.3.4.2 結果判斷:按照不同熒光檢測儀和商品化試劑盒設定的結果判斷

8.4 B.4 臨牀意義

泌尿生殖標本檢測淋球菌核酸可作爲淋球菌感染的依據。

8.5 B.5 注意事項

B.5.1 核酸擴增試驗應在經過省級以上臨檢驗中心認證的實驗室開展。

B.5.2 實驗室應嚴格按照《醫療機構臨牀基因擴增管理辦法》規範管理,實驗人員應進行專業培訓,嚴格按照試劑盒介紹要求進行操作。

B.5.3 應使用經國家批准的試劑盒。

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