3 基本信息
ICS 11.020
C 59
中華人民共和國衛生行業標準WS 216—2018《登革熱診斷》（Diagnosis for dengue fever）由中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會2018年3月6日《關於發佈〈丙型肝炎診斷〉等7項衛生行業標準的通告》（國衛通〔2018〕4號）發佈。本標準自2018年8月1日起施行，代替WS 216—2008《登革熱診斷》，WS 216—2008同時廢止。
4 發佈通知
關於發佈《丙型肝炎診斷》等7項衛生行業標準的通告
國衛通〔2018〕4號
現發佈《丙型肝炎診斷》等7項衛生行業標準，編號和名稱如下：
一、強制性衛生行業標準
WS 213—2018 丙型肝炎診斷（代替WS 213—2008 ）
WS 216—2018 登革熱診斷（代替WS 216—2008 ）
WS 273—2018 梅毒診斷（代替WS 273—2007 ）
WS 291—2018 麻風病診斷（代替WS 291—2008）
二、推薦性衛生行業標準
WS/T 590—2018 基孔肯雅熱診斷
上述標準自2018年8月1日起施行,WS 213—2008 、WS 216—2008、WS 273—2007、WS 291—2008 同時廢止。
特此通告。
國家衛生計生委
2018年3月6日
5 前言
本標準第5章爲強制性條款,其餘爲推薦性條款。
本標準按照GB/T 1.1—2009給出的規則起草。
本標準代替WS 216—2008《登革熱診斷標準》。
本標準與WS 216—2008相比，主要技術變化如下：
——修改了適用範圍（見第1章，2008年版的第1章）；
——術語和定義刪除了束臂試驗，增加了重症登革熱和NS1抗原（見第2章，2008年版的第2章）；
——修改了臨牀表現（見第3章，2008年版的3.2）；
——修改了實驗室檢查（見第3章，2008年版的3.3）；
——刪除了“血液濃縮；低白蛋白血癥”指標（見2008年版的3.3.3）；
——增加了“發病5d內的登革病毒NS1抗原檢測陽性”指標（見第3章，2008年版的3.3）；
——修改了疑似病例（見第5章，2008年版的5.1）；
——修改了臨牀診斷病例（見第5章，2008年版的5.2）；
——修改了確診病例（見第5章，2008年版的5.3）；
——增加了重症病例（見第5章，2008年版的的5.4）；
——調整了附錄A和附錄B的順序；
——附錄A中增加了“酶聯免疫法檢測登革病毒NS1抗原”方法，刪除了原有的“血凝抑制（HI）試驗檢測登革病毒血凝抑制抗體”方法（見附錄A和附錄B，2008年版的附錄A和附錄B）；
——修改了附錄D中內容，將原有的“登革出血熱”和“登革休克綜合徵”改爲“重症登革熱”，將重症登革熱的高危人羣和早期識別重症病例的預警指徵納入（見附錄D，第5章，2008年版的附錄D）。
本標準起草單位：廣東省疾病預防控制中心、廣州市第八人民醫院、中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所、中國疾病預防控制中心、首都醫科大學附屬北京地壇醫院、中國軍事醫學科學院微生物流行病研究所。
本標準主要起草人：何劍峯、張復春、王世文、殷文武、李建東、李興旺、秦成峯、王建、吳德、鄧愛萍。
本標準所代替標準的歷次版本發佈情況爲：
——WS 216—2001；
——WS 216—2008。
6 標準正文
登革熱診斷
6.1 1 範圍
本標準適用於各級各類醫療衛生機構及其醫務人員對於登革熱病例的診斷。
6.2 2 術語和定義
下列術語和定義適用於本文件。
6.2.1 2.1 重症登革熱 severe dengue
登革熱的一種嚴重類型，臨牀表現爲嚴重出血、休克、嚴重臟器損傷等。
6.2.2 2.2 NS1 抗原 NS1 antigen
登革病毒非結構蛋白中的一種糖蛋白，其大量存在於感染細胞的表面，可作爲早期診斷的特異性指標。
6.3 3 診斷依據
6.3.1 3.1 流行病學史
發病前14d內，曾經到過登革熱流行區，或居住場所或工作場所周圍1個月內曾出現過登革熱病例。
6.3.2 3.2 臨牀表現
3.2.1 急性起病，突發高熱，明顯疲乏、厭食、噁心等，常伴有較劇烈的頭痛、眼眶痛、全身肌肉痛、骨關節痛等症狀，可伴面部、頸部、胸部潮紅，結膜充血等。
3.2.2 皮疹：於病程第 3 天～第 6 天在顏面四肢出現充血性皮疹或點狀出血疹。典型皮疹爲見於四肢的針尖樣出血點及“皮島”樣表現等。皮疹分佈於四肢軀幹或頭面部，多有癢感，不脫屑。持續 3 d～5 d。
3.2.3 出血傾向：部分病人可出現不同程度的出血表現，如皮下出血、注射部位瘀點、牙齦出血、鼻衄及束臂試驗陽性等。
3.2.4 嚴重出血：皮下血腫，肉眼血尿，消化道、胸腹腔、陰道、顱內等部位出血。
3.2.5 嚴重臟器損傷：急性心肌炎、急性呼吸窘迫綜合徵、急性肝損傷、急性腎功能不全、中樞神經系統損傷等表現。
3.2.6 休克：心動過速、肢端溼冷、毛細血管充盈時間延長＞3s、脈搏細弱或測不到、脈壓差減小或血壓測不到等。
6.3.3 3.3 實驗室檢查
3.3.2 登革病毒 IgM 抗體陽性（見附錄 A 中 A.1、A.2）。
3.3.3 發病 5d 內的登革病毒 NS1 抗原檢測陽性（見 A.3）。
3.3.4 登革病毒恢復期血清特異性 IgG 抗體滴度比急性期有 4 倍及以上增長或陽轉（見 A.4、A.5）。
3.3.5 從急性期病人血液、腦脊液或組織等中分離到登革病毒（見附錄 B 中 B.1、B.2）。
3.3.6 應用 RT-PCR 或實時熒光定量 RT-PCR 檢出登革病毒核酸（見 B.3、B.4）。
6.4 4 診斷原則
依據患者的流行病學證據、臨牀表現及實驗室檢查結果進行綜合判斷。
6.5 5 診斷
6.5.1 5.1 疑似病例
符合下列一項可診斷爲疑似病例：
a) 符合 3.1，並同時符合 3.2.1。
b) 同時符合 3.2.1、3.3.1。
6.5.2 5.2 臨牀診斷病例
符合下列一項可診斷爲臨牀診斷病例：
a) 符合 5.1a），並同時符合 3.2.2、3.2.3 中任一項和 3.3.1。
b) 符合 5.1，並同時符合 3.3.2、3.3.3 中任一項。
6.5.3 5.3 確診病例
符合5.1或5.2，並同時符合3.3.4、3.3.5、3.3.6中任一項可診斷爲確診病例。
6.5.4 5.4 重症登革熱
符合5.2或5.3，並同時符合3.2.4、3.2.5、3.2.6中任一項可診斷重症登革熱。
6.6 6 鑑別診斷
登革熱應與麻疹、風疹、猩紅熱、流行性感冒、基孔肯雅熱、寨卡病毒病相鑑別；重症登革熱應與鉤端螺旋體病、腎綜合徵出血熱、恙蟲病等相鑑別。參見附錄C與附錄D。
7 附錄A（規範性附錄）登革熱血清學檢測方法
7.1 A.1 應用IgM捕捉酶聯免疫吸附試驗（Mac-ELISA）檢測登革病毒IgM抗體
7.1.1 A.1.1 原理
根據抗原抗體特異性結合的原理，利用抗人μ鏈單克隆抗體捕獲待檢測血清中的IgM，再加入特異性抗原和相應酶標單克隆抗體，加底物顯色。顯色程度與特異性IgM抗體含量呈正相關。
7.1.2 A.1.2 材料和試劑
所需材料和試劑如下：
a) 洗板機、酶標儀、恆溫溫箱或水浴箱（37℃±2℃）；
b) 10μL～100μL 可調移液器、10mL 吸管；
7.1.3 A.1.3 檢測方法
具體步驟如下：
a) 在一系列試管中，將陰、陽性對照血清，臨界值較準血清和待檢血清稀釋成 1∶100；
b) 吸取所需量的純化登革病毒抗原和等體積辣根過氧化物酶標記單克隆抗體至另一干淨的玻璃瓶或試管中，混勻後置室溫作用 1h；
c) 混合好標記單克隆抗體和抗原後，在 10min 內各吸取 100μL 稀釋好的病人標本和對照血清至測試板上相應的微孔中，37℃作用 1h；
d) 棄血清，用洗滌液重複洗滌 6 次，吸水紙上扣幹，分別加 100μL 上述作用好的登革病毒抗原和酶標單克隆抗體複合物，37℃作用 1h；
e) 棄登革病毒抗原和酶標單克隆抗體複合物，用洗滌液重複洗滌 6 次，吸水紙上扣幹，每孔加入100μL 的 TMB（四甲基聯苯胺），室溫作用 10min 充分顯現藍色後，每孔加入 100μL 的終止液，混勻；
f) 在 30min 內於 450nm 波長處讀取每孔的吸光度。
7.1.4 A.1.4 結果判斷
7.1.4.1 A.1.4.1 酶標儀讀數結果判斷
判斷標準爲：在NC/CO＜1且PC/CO＞1的情況下，若S/CO＜0.9，則結果爲陰性，若S/CO＞1.1，則結果爲陽性，若S/CO＝0.9～1.1，則標本需重做。
注：S爲待檢血清的吸光度；NC爲陰性對照血清的吸光度；PC爲陽性對照血清的吸光度；CO爲臨界較準血清的吸光度平均值。
7.1.4.2 A.1.4.2 目測法
未加終止液前，在陽性對照血清爲深藍色、陰性對照血清爲無色的情況下，若樣品孔的顏色比臨界較準血清孔深者爲陽性，樣品孔的顏色比臨界較準血清孔淺者爲陰性。
7.1.5 A.1.5 意義
IgM抗體陽性，表示患者新近感染登革病毒，適用於登革熱早期診斷。
7.2 A.2 應用間接酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測登革病毒IgM抗體
7.2.1 A.2.1 原理
根據抗原抗體特異性結合的原理，用純化的登革病毒基因工程表達抗原包被塑料板，與稀釋的待檢血清中的特異性抗體結合，其中血清IgM部分又與後加入的酶標記的抗人IgM結合，通過酶與底物的作用產生可見的顏色反應，顯色程度與特異性IgM抗體含量呈正相關。
7.2.2 A.2.2 材料和試劑
所需材料和試劑如下：
a) 洗板機、酶標儀、恆溫溫箱或水浴箱（37℃±2℃）；
b) 10μL～100μL 可調移液器、10mL 吸管；
7.2.3 A.2.3 檢測步驟
具體步驟如下：
a) 將檢測血清用樣品稀釋液做 1∶50 稀釋。（先將 10μL 血清加入到 90μL 的樣品稀釋液中混勻，再將 1∶10 的稀釋血清用樣品稀釋液做 1∶5 稀釋充分混勻。標本稀釋後應在 2h 內使用。）
b) 將濃縮洗滌液加入 720mL（96T）蒸餾水中混勻備用。
c) 取出已包被板，加入已稀釋血清 100μL/孔，同時設陰、陽性對照及空白對照各 2 孔（陰、陽性對照孔分別直接加入相應對照血清 100μL/孔，空白對照加入洗滌液 100μL/孔），振盪均勻後，於 37℃水浴箱溫育 40min。
d) 溫育後，甩去板內液體，用洗滌液注滿各孔，靜置 1min 後甩幹，重複洗滌 5 次，扣幹。
e) 加入酶標記物 50μL/孔（空白孔不加），振盪均勻後，於 37℃水浴箱溫育 30min。
f) 溫育後，甩去板內液體，用洗滌液注滿各孔，靜置 1min 後甩幹，重複洗滌 5 次，扣幹。
g) 每孔加入底物 A、B 液各 50μL，37℃避光顯色 10min，再加入終止液 50μL/孔，於 450nm 測OD 值。
7.2.4 A.2.4 結果判斷
臨界值（cut-off）=0.2+陰性對照均值（N＜0.05 時，按0.05計算）。樣品OD值大於臨界值爲陽性，樣品OD值小於臨界值爲陰性。樣品OD值在臨界值正負10％範圍內爲可疑，建議用其他方法複試。
7.2.5 A.2.5 意義
IgM抗體陽性，表示患者新近感染登革病毒，適用於登革熱早期診斷。
7.3 A.3 酶聯免疫法檢測登革病毒NS1 抗原方法
7.3.1 A.3.1 原理
在微孔條上預包被登革病毒的單克隆抗體，該抗體可與登革熱病例血清中的登革病毒中的NS1抗原特異性結合，再與辣根過氧化酶標記抗NS1抗體試劑進行第二次溫育，當樣品中存在登革病毒NS1抗原時將形成“包被抗體-NS1-酶標抗體”複合物。加入顯色劑，複合物上連接的辣根過氧化物酶催化顯示劑反應，生成藍色產物，終止反應後，變爲黃色，若樣品中無登革病毒NS1抗原則不顯示。
7.3.2 A.3.2 材料
10μL，100μL，200μL，1mL移液器各一把；溫箱一臺，洗板機一臺，酶標儀一臺。稀釋血清用的試管、吸水紙；蒸餾水或去離子水；登革病毒NS1抗原酶聯免疫診斷試劑盒。
7.3.3 A.3.3 檢測步驟
具體步驟如下：
a) 將試劑盒在冰箱中取出，放置室溫平衡 30min，使用前將試劑輕輕振盪混勻；
c) 編號：將樣品對應微孔板編號，每板設陰性對照 3 孔，陽性對照 2 孔和空白對照 1 孔；
d) 加稀釋液：每孔加稀釋液 50µL，空白孔除外；
e) 加樣：分別在相應孔加入待測樣品或陰陽性對照各 50µL，空白孔除外；
f) 溫育：用封板膜封板後，置 37℃溫育 60min；
g) 每孔加酶標試劑 50µL，空白孔除外，輕輕振盪混勻；
h) 溫育：用封板膜封板後，置 37℃溫育 30min；
i) 洗板：小心揭掉封板膜，用洗板機洗滌 5 遍，最後 1 次儘量扣幹；
j) 顯色：每孔加入顯色劑 A、B 液各 50µL，輕輕振盪混勻，37℃避光顯色 15min；
k) 測定：每孔加終止液 50µL，10min 內測定結果。設定酶標儀波長於 450nm 處［建議使用雙波長 450nm/（600～650）nm 檢測］，用空白孔調零後測定各孔 A 值。
7.3.4 A.3.4 結果判定
臨界值計算：臨界值=0.10+陰性對照孔A值均值（陰性對照孔A值低於0.05者以0.05計算）。
陰性對照的正常值範圍：陰性對照孔A≤0.1（若1孔A＞0.1應捨棄，若兩孔或兩孔以上陰性對照＞0.1，應重複實驗）。
陽性對照正常值範圍：A≥0.8。
7.3.5 A.3.5 意義
陽性結果表示患者新近存在登革病毒感染，適用於登革熱早期診斷。
7.4 A.4 用免疫熒光法（FA/IFA）檢測登革病毒IgG抗體
7.4.1 A.4.1 原理
某些熒光素（常用異硫氰酸熒光素）能與抗體蛋白分子結合，而不喪失抗體活力，仍能和相應的抗原發生特異免疫反應，產生免疫複合物，這種複合物由於有熒光色素的參與，在熒光顯微鏡下顯示熒光，表明有特異性抗原存在。直接免疫熒光法可用於檢測感染細胞內的特異性抗原，間接免疫熒光法可查待檢血清中的特異性抗體。
7.4.2 A.4.2 儀器與試劑
所需儀器與試劑如下：
a) 10μL～100μL，100μL～1000μL 可調移液器各 1 支；
b) 登革病毒 1～4 型抗原片（登革標準毒株感染 BHK、Vero 或 C6/36 細胞製備，低溫乾燥保存）及相應單克隆抗體（陽性對照）、陰性血清；
e) 常用稀釋液：pH7.2～7.4PBS、伊文斯蘭、封片膠等；
f) 熒光顯微鏡。
7.4.3 A.4.3 檢測步驟
具體步驟如下：
a) 取出抗原片，冷風吹乾；
b) 用 pH7.2～7.4PBS 稀釋待檢血清，從 1∶20 開始，對倍稀釋至所需稀釋度；
c) 用移液器依次從高稀釋度向低稀釋度逐個加入稀釋的待檢血清於四個型的登革病毒抗原片孔中，每型各加 2 孔待檢系列稀釋血清，血清量以完全覆蓋抗原面而不溢出孔外爲準，置溼盒內，在 37℃水浴孵育 30min（每次試驗同時作陰、陽性對照）；
d) 用 pH7.2～7.4PBS 漂洗 3 次，每次約 30s～1min，再用蒸餾水洗 1 次，冷風吹乾；
e) 用 pH7.2～7.4PBS 稀釋熒光抗體，使其內含 2 個工作單位和 1∶8000 伊文斯蘭的熒光抗體，加入各孔中，使完全覆蓋抗原面，置溼盒中，37℃水浴作用 30min，取出，同上漂洗及吹乾；
7.4.4 A.4.4 結果判斷
特異性熒光呈黃綠色顆粒，分佈在感染細胞漿中。根據熒光亮度和陽性細胞在細胞總數中所佔的比例可將熒光反應大致區分爲“+～++++”，無熒光者爲“－”。檢測抗體滴度時，以特異熒光達“++”最高血清稀釋度的倒數表示。
7.4.5 A.4.5 意義
陽性結果只能說明受檢者可能曾存在登革病毒感染，但血清抗體效價達1∶80或以上者有診斷參考意義，若恢復期血清抗體效價比急性期血清抗體效價有4倍或以上增長可確診最近存在登革病毒感染。
7.5 A.5 中和試驗（NT）
7.5.1 A.5.1 原理
當人體感染登革病毒後，血清中可產生保護性的中和抗體，登革病毒與這種特異性抗體作用後，能被特異性地“中和”，抑制登革病毒的複製與繁殖，使其失去感染能力。中和試驗包括動物中和試驗、組織培養中和試驗和空斑減少中和試驗三種，每種中和試驗又分爲固定病毒稀釋血清法和固定血清稀釋病毒法兩種。
動物中和試驗由於需要特殊的感染動物房，一般的實驗室很難做到，所以更多的實驗室採用的是組織培養中和試驗和空斑減少中和試驗，其中空斑減少中和試驗比組織培養中和試驗更敏感、特異，但由於前者對操作技術的要求更高，而且病毒噬斑小，出斑時間長，對細胞覆蓋培養基的要求也高，故一般實驗室多用的是組織培養中和試驗。
7.5.2 A.5.2 儀器與試劑
所需儀器與試劑如下：
a) 50μL～200μL、1mL 可調移液器，200μL、1mL 無菌吸頭；
e) 登革病毒 1～4 型標準毒株、C6/36 細胞、陽性和陰性對照血清；
g) 生長液（200mL）：Eagle's MEM 溶液 174mL，3％谷氨醯胺 2mL，1 萬單位青鏈黴素 2mL，7.5％碳酸氫鈉 2mL，新生小牛血清 20mL，臨用前配製混勻；
h) 維持液的配製（200mL）：Eagle's MEM 溶液 190mL，3％谷氨醯胺 2mL，1 萬單位青鏈黴素 2mL，7.5％碳酸氫鈉 2mL，新生小牛血清 4mL，臨用前配製混勻。
7.5.3 A.5.3 檢測步驟
7.5.3.1 A.5.3.1 病毒滴度測定
具體步驟如下：
a) 病毒懸液製備與保存：將新鮮傳代收穫的登革病毒 1～4 型標準毒株的組織培養病毒懸液或乳小白鼠腦組織製備的病毒懸液，經離心沉澱後吸出上清液，加入 20％無抗體小牛血清後分裝於細胞凍存管，迅速放入－70℃以下冰箱保存。
b) 病毒接種：每型登革病毒各取出 1 小管冰凍的病毒，在冷水中迅速溶化，用維持液將各型病毒分別做 10 倍稀釋，從 10-2到 10-7，用無菌 1.5mL 塑料離心管在冰盒上進行。每個稀釋度病毒加 4 孔，每孔加 50μL，然後每孔加入 C6/36 細胞（濃度爲 1×106/mL）50μL，置 CO2培養箱內培養，溫度 33℃，溼度 80％。每天觀察細胞病變，共觀察 7d，記錄觀察結果。
c) TCID50的計算：根據細胞病變計算 TCID50，見表 A.1。
表A.1 TCID50的計算
病毒稀釋度 | 細胞病變孔數／接種數 | 累計 | 比數 | 細胞病變百 分比 % | |||
(+)孔 | （-）孔 | (+)孔 | （-）孔 | ||||
10-3 | 4/4 | 4 | O | 9 | 0 | 9/9 | 100 |
10-4 | 3/4 | 3 | 1 | 5 | 1 | 5/6 | 83 |
10-5 | 2/4 | 2 | 2 | 2 | 3 | 2/5 | 40 |
10-6 | 0/4 | 0 | 4 | 0 | 7 | 0/7 | 0 |
在這個例子中，能引起50％的組織培養板出現細胞病變的病毒稀釋度在10-5和10-6之間，計算如下：
距離比例=（高於50%的細胞病變百分數-50）÷（高於50%的細胞病變百分數-低於50%的細胞病變百分數）=（83-50）÷（83-40）=0.7
距離比例與高於50%細胞病變稀釋度的對數相加即爲TCID50（10-4.7）。由此得出100TCID50爲10-2.7。
7.5.3.2 A.5.3.2 組織培養中和試驗（固定病毒稀釋血清法）
具體步驟如下：
a) 將待測血清做系列倍比稀釋，1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32„„根據估計的血清效價決定稀釋倍數，用無菌 1.5mL 塑料離心管在冰盒上進行。
b) 將上述測定好的病毒稀釋成 100TCID50/0.2mL，用無菌 1.5mL 塑料離心管在冰盒上進行。
c) 將稀釋好的血清與稀釋好的病毒懸液各取等量混勻，用無菌 1.5mL 塑料離心管在冰盒上進行，置 37℃水浴中作用 1h。
d) 在平底微量 96 孔組織培養板上，每個稀釋度病毒加 4 孔，每孔加 50μL，然後每孔加入 C6/36細胞（濃度爲 1×106/mL）50μL，置 CO2培養箱內培養，溫度 33℃，溼度 80％。每天觀察細胞病變，共觀察 7d，記錄觀察結果。
e) 50％血清中和終點的計算。根據細胞病變計算 50％血清中和終點，即能保護 50％組織培養管不產生病變的血清稀釋度，計算方法見表 A.2。
表A.2 50％血清中和終點的計算
血清稀釋度 | 細胞病變孔數／接種數 | 累計 | 比數 | 百分比% | |||
(+)孔 | （-）孔 | (+)孔 | （-）孔 | ||||
1：4( 10-0.6) | 0/4 | 0 | 4 | 0 | 16 | 0/16 | 0 |
1：8( 10-0.9) | 0/4 | 0 | 4 | 0 | 12 | 0/12 | 0 |
1: 16 ( 10-1.2) | 0/4 | 0 | 4 | 0 | 8 | 0/8 | 0 |
1：32(10-1.5) | 1/4 | l | 3 | 1 | 4 | 1/5 | 20 |
1: 64 ( 10-1.8) | 3/4 | 3 | 1 | 4 | 1 | 4/5 | 80 |
1：128（10-2.1） | 4/4 | 4 | O | 8 | 0 | 8/8 | 100 |
上述例子能保護50％的組織培養細胞孔不致細胞病變的血清稀釋度在1∶32～1∶64之間，具體計算如下：
距離比例＝（50％－低於50％的病變率）÷（高於50％的病變率－低於50％的病變率）＝（50－20）÷（80－20）＝30÷60＝0.5低於50％病變率血清稀釋度的對數＋距離比例乘稀釋係數的對數＝－1.5＋0.5×（－0.3）= －1.5＋（－0.15）= －1.65，－1.65的反對數＝1/45即1∶45的血清可保護50％細胞不產生病變。
7.5.4 A.5.4 意義
中和試驗是登革病毒血清學診斷上最特異、最敏感的方法。既往感染過登革病毒的人在檢測不到HI抗體時也可檢出中和抗體。初次感染登革病毒可用中和試驗進行登革病毒四種血清型別區分鑑定。恢復期血清中可見到相應的單一型別反應。第二或第三次感染，不能用中和試驗進行血清型別鑑定。
7.6 A.6 應用間接酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測登革病毒IgG抗體
7.6.1 A.6.1 原理
根據抗原抗體特異性結合的原理，用純化的登革病毒基因工程表達抗原包被塑料板，與稀釋的待檢血清中的特異性抗體結合，其中血清IgG部分又與後加入的酶標記的抗人IgG結合，通過酶與底物的作用產生可見的顏色反應，顯色程度與特異性IgG抗體含量呈正相關。
7.6.2 A.6.2 材料與試劑
所需材料與試劑如下：
a) 洗板機、酶標儀、恆溫溫箱或水浴箱（37℃±2℃）；
b) 10μL～100μL 可調移液器、10mL 吸管；
7.6.3 A.6.3 檢測步驟
具體步驟如下：
a) 將檢測血清用樣品稀釋液做 1∶50稀釋。（先將10μL 血清加入到 90μL的樣品稀釋液中混勻，再將 1∶10 的稀釋血清用樣品稀釋液做 1∶5 稀釋充分混勻，標本稀釋後應在 2h 內使用）。
b) 將濃縮洗滌液加入 720mL（96T）蒸餾水中混勻備用。
c) 取出已包被板，加入已稀釋血清 100μL /孔，同時設陰、陽性對照及空白對照各 2 孔（陰、陽性對照孔分別直接加入相應對照血清 100μL/孔，空白對照加入洗滌液 100μL/孔），振盪均勻後，於 37℃水浴箱溫育 40min。
d) 溫育後，甩去板內液體，用洗滌液注滿各孔，靜置 1min 後甩幹，重複洗滌 5 次，扣幹。
e) 加入酶標記物 50μL/孔（空白孔不加），振盪均勻後，於 37℃水浴箱溫育 30min。
f) 溫育後，甩去板內液體，用洗滌液注滿各孔，靜置 1min 後甩幹，重複洗滌 5 次，扣幹。
g) 每孔加入底物 A、B 液各 50μL，37℃避光顯色 10min，再加入終止液 50μL/孔，於 450nm 測OD 值。
7.6.4 A.6.4 結果判斷
臨界值（cut-off）=0.150+陰性對照均值（N＜0.05 時，按0.05計算）。
樣品OD值大於臨界值爲陽性，樣品OD值小於臨界值爲陰性。樣品OD值在臨界值正負10％範圍內爲可疑，建議用其他方法複試。
7.6.5 A.6.5 意義
病人恢復期血清比急性期血清IgG抗體滴度有4倍及以上升高，可確診感染，單份血清檢測一般表明其曾存在登革病毒感染，但抗體滴度大於等於1∶320時，結合臨牀表現及流行病學史，亦可確定爲新近存在病毒感染。
8 附錄B（規範性附錄）登革熱病原學檢測方法
8.1 B.1 C6/36 白紋伊蚊細胞分離登革病毒
8.1.1 B.1.1 原理
登革病毒是一種具有嚴格的細胞內存活的生物，必鬚生活在活的細胞組織內，C6/36白紋伊蚊細胞對登革病毒十分敏感，根據觀察病毒對其產生的變化（病變等現象）和應用特異、敏感的檢測技術，檢出病毒的存在和型別。
8.1.2 B.1.2 儀器與試劑
所需儀器與試劑如下：
a) 50 μL～200μL、1mL 可調移液器，200μL、1mL 無菌吸頭；
d) C6/36 細胞；
f) 生長液（200mL）：Eagle's MEM 溶液 174mL，3％谷氨醯胺 2mL，1 萬單位青鏈黴素 2mL，7.5％碳酸氫鈉 2mL，新生小牛血清 20mL，用前混勻；
g) 維持液的配製（200mL）：Eagle's MEM 溶液 190mL，3％谷氨醯胺 2mL，1 萬單位青鏈黴素 2mL，7.5％碳酸氫鈉 2mL，新生小牛血清 4mL，用前混勻；
h) 標本處理液（100mL）：Eagle's MEM 溶液 90mL，50µg/mL 慶大黴素 100μL，1000µg/mL 兩性黴素 B1mL 和 1000U/mL 青鏈黴素 1mL，小牛血清 2mL，用 7.5％碳酸氫鈉溶液調至 pH7.2，用前混勻。
8.1.3 B.1.3 標本的採集及處理
具體步驟如下：
a) 患者：無菌採集發病後 5d 內靜脈血 3mL，放冰壺送實驗室分離血清，接種組織細胞培養，不能及時接種的，將血清置-20℃保存；
c) 蚊：採集吸過血的埃及伊蚊，白紋伊蚊或其他可疑蚊種，用 0.50mol/L（10％）葡萄糖液餵養，至胃血完全消化後置-20℃，待死後按蚊種及捕獲地點分組，以 10 只～20 只一組爲宜，經生理鹽水沖洗數次後，轉入研磨器,加 1mL 標本處理液，研碎均勻，置預冷 4℃的離心機上，10000r/min 離心 10min，取上清液於 4℃作用 2h 處理後接種 C6/36 細胞。
8.1.4 B.1.4 病毒分離
C6/36（白紋伊蚊純系細胞株）傳代細胞長成單層後（在25cm2細胞瓶、細胞管、24孔細胞培養板等），倒去細胞生長液換成細胞維持液，如果傳代後立即接種，可用細胞生長液，在25cm2細胞瓶接種患者血清20μL，細胞管和24孔細胞培養板各接種3μL，蚊懸液或組織懸液根據濃度取接種量，加樣後適度混勻，置35℃、CO2培養箱靜止培養，觀察7d，若細胞出現膨大至融合，折光度增強、顆粒增多等現象，
取細胞懸液用熒光PCR檢測登革病毒核酸（不需提取病毒RNA），若7d後細胞不出現病變，需盲傳1代～2代，仍不出現病變者經核酸檢測，陰性者作陰性報告。
8.1.5 B.1.5 間接免疫熒光試驗（FA/IFA）鑑定登革病毒
8.1.5.1 B.1.5.1 試驗方法
具體步驟如下：
a) 細胞片的製備：把出現“++”病變的 C6/36 細胞管倒去維持液（若不出現病變，則需培養 7d再製片），用 pH7.2PBS 洗 2 次後加 PBS3mL，用滴管把細胞從管壁上吹下，吹散，2000r/min離心 5min，棄去 PBS，加 0.2mL PBS 把沉渣吹散，滴加在 10 孔的載玻片各孔中，冷風吹乾，加冷丙酮固定 10min，用 PBS 沖洗 2 次，蒸餾水漂洗 1 次，冷風吹乾，-20℃保存。正常 C6/36細胞對照按同法制片；
b) 試驗方法：取出保存的待鑑定細胞片或腦組織片，冷風吹乾，於各孔中按順序滴加 4 個型登革病毒使用單位的單克隆抗體，各型 2 孔，對照 2 孔滴加 PBS，置溼盒內 37℃水浴 30min，取出用 PBS 沖洗 3 次，蒸餾水漂洗 1 次，冷風吹乾，滴加含 130μmol/L（1∶8000）伊文思藍的 2單位抗鼠 IgG 熒光抗體，置溼盒內 37℃水浴 30min，用 PBS 沖洗 3 次，蒸餾水漂洗 1 次，冷風吹乾，用甘油緩衝液封片，鏡檢，記錄結果。
8.1.5.2 B.1.5.2 結果判斷
特異性免疫熒光呈黃綠色顆粒，分佈在感染細胞的胞漿內，正常組織細胞被染成橙紅色或暗紅。
8.1.5.3 B.1.5.3 意義
從病人血液、組織或蚊媒中分離出登革病毒，可確診存在登革病毒感染，經鑑定，可確定病毒型別。
8.2 B.2 應用乳小白鼠分離登革病毒
8.2.1 B.2.1 原理
新生小白鼠對登革病毒十分敏感，根據觀察病毒對其產生的致病等現象和應用特異、敏感的檢測技術，檢出病毒的存在和型別。
8.2.2 B.2.2 儀器和試劑
參考B.1.2。C6/36白紋伊蚊細胞改用1日齡～3日齡乳小白鼠。
8.2.3 B.2.3 標本採集及處理
見B.1.3。
8.2.4 B.2.4 病毒分離
每一標本接種一窩1日齡～3日齡小白鼠，每隻腦內接種全血或1∶10血清或蚊懸液、組織懸液10μL～20μL，接種後48h內死亡者作非特異性死亡，棄去。存活者觀察至10d左右仍未發病時，剖取其中2只，取腦，用pH8.0肉湯製成10％懸液，盲傳1日齡～3日齡小白鼠一窩，其餘的及盲傳的均觀察至第四周，未發病作陰性結果。在觀察期內若發病（松毛、蜷縮、活動力降低、站立不穩、抽搐、離羣、不進食、癱瘓等症狀）則剖取半邊腦，按盲傳法制成10％鼠腦懸液，轉種1日齡～3日齡小白鼠，並作無菌試驗，另一半腦置5.43mol/L（50％）甘油緩衝液中低溫保存。無菌試驗陰性而仍出現以上症狀的乳鼠作爲可疑毒株傳代、保種，並進行鑑定。
8.2.5 B.2.5 病毒鑑定
具體步驟和方法如下：
a) 腦組織片的製備：取發病瀕死的小鼠腦組織以冰凍切片製成 10 孔組織片，經冷風吹乾，冷丙酮固定 10min，沖洗、吹乾後放-20℃保存。正常腦組織同法制作。
b) 試驗方法、結果和意義：參考 B.1.5。
8.3 B.3 RT-PCR技術檢測登革病毒RNA及型別鑑定
8.3.1 B.3.1 原理
PCR技術（聚合酶鏈反應）是利用雙鏈DNA分子鹼基配對原則，在一定條件下擴增DNA片段的體外擴增方法。它的特異性取決於兩個人工合成的寡核苷酸引物的序列，引物與待擴增片段兩條鏈兩段DNA序列分別互補，待擴增DNA在變性溫度下分解爲二條單鏈模板，在復性溫度引物與模板兩端的DNA序列分別復性（雜交-鹼基配對），在延伸溫度和單核苷酸存在的條件下，由TaqDNA聚合酶催化，引導引物的5′端向3′端方向延伸合成新鏈，是一個重複進行的熱變性復性延伸的溫控循環過程，隨着循環次數的增加，DNA產量呈指數上升，經過20個循環以後，從微量基因材料，特異性地擴增可達數百萬倍。登革病毒含RNA基因組，因此PCR前需經過逆轉錄酶作用，合成第一條cDNA鏈（RT），再進行擴增（PCR），即RT-PCR。設計一對通用引物可擴增登革病毒組基因。設計不同型登革病毒的引物對，可擴增出不同的血清型病毒的基因產物。根據基因擴增產物的片段大小可判斷是否登革病毒或某一型登革病毒。
8.3.2 B.3.2 設備和試劑
8.3.2.1 B.3.2.1 設備
移液器（10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL）及配套吸頭、離心管（1.5mL、0.2mL）及管架、臺式高速離心機、普通冰箱、旋渦混合器、電泳儀及電泳槽、微波爐、PCR儀、紫外分析儀等。
8.3.2.2 B.3.2.2 試劑
隨機引物、登革病毒特異性引物、RNA提取試劑、AMV逆轉錄試劑盒、PCR試劑盒、10×Tris-硼酸（TBE）緩衝液（108gTris粉，9.3g依地酸二鈉EDTA－Na2，55g硼酸，完全溶解後用HCl調pH至8.0，加水至1000mL，用前稀釋成0.5倍或1倍）、加樣緩衝液（0.5％溴酚藍和體積比爲40％的蔗糖溶於水後，分裝於4℃保存）、溴化乙錠（10mg/mL，使用濃度爲0.5μg/mL）、瓊脂糖等。見表B.1。
引物 | 序列(5'→3') | 使用濃度 | 擴增片段大小bp | 型特異性 |
Dl | TCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG | 0.5 μmol/L | 通用 | |
D2 | TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC | O．5 μmol/L | 511 (D1和D2) | 通用 |
TS1 | CGTCTCAGTGATCCGGGGG | 0.5 μmol/L | 482 (D1和TSl) | I型 |
TS2 | CGCCACAAGGGCCATGAACAG | O．5 μmol/L | 119 (D1和TS2) | II型 |
TS3 | TAACATCATCATGAGACAGAGC | O．5 μmol/L | 290 (D1和TS3) | III型 |
TS4 | CTCTGTTGTCTTAAACAAGAGA | O．5 μmol/L | 392 (D1和TS4) | Ⅳ型 |
8.3.3 B.3.3 檢測步驟
8.3.3.1 B.3.3.1 病毒RNA的提取
待檢標本用RNA提取試劑提取病毒RNA，按照試劑說明進行操作，製備模板RNA。
8.3.3.2 B.3.3.2 逆轉錄合成cDNA
以隨機引物作爲逆轉錄引物，根據AMV逆轉錄酶反應要求，按試劑介紹操作，以病毒RNA爲模板合成cDNA。
8.3.3.3 B.3.3.3 登革病毒4種血清型通用引物的PCR擴增
以D1和D2爲引物，以隨機引物合成的cDNA爲模板，PCR擴增目的基因，反應條件爲94℃預變性2min，94℃30s、55℃30s、68℃30s，擴增9個循環後，94℃30s、55℃30s、68℃30s（每個循環增加10s），擴增25個循環，68℃延伸10min。
8.3.3.4 B.3.3.4 登革病毒型特異性引物的多重PCR擴增
以TS1、TS2、TS3、TS4和D1爲引物，以通用引物PCR擴增產物爲模板，多重PCR擴增目的基因，反應條件爲94℃預變性2min，94℃15s、55℃15s、68℃30s，擴增10個循環後，94℃15s、55℃15s、68℃30s（每個循環增加5s），擴增10個循環，68℃延伸10min。
8.3.4 B.3.4 結果判斷
擴增產物用1％～2％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，如果條帶的分子量與預期片段大小相同，表明爲相應的登革病毒核酸擴增陽性。
8.3.5 B.3.5 意義
此法可對早期病例登革病毒的檢測及分型鑑定，基因擴增產物可進一步進行序列測定和分析。
8.4 B.4 TaqMan探針實時熒光PCR檢測登革病毒RNA
8.4.1 B.4.1 原理
登革病毒有四個血清型，根據四型登革病毒共有基因特定的序列，合成一對特異性引物和一條特異性的熒光雙標記探針。該探針與登革病毒特有的共同基因特異性結合，結合部位位於引物結合區域內。探針的5′端和3′端分別標記不同的熒光素，如5′端標記FAM熒光素，它發出的熒光能夠被檢測儀器接收，稱爲報告熒光基團（用R表示），3′端一般標記TAMRA熒光素，它在近距離內能吸收5′端報告熒光基團發出的熒光信號，稱爲淬滅熒光基團（用Q表示，淬滅熒光基團也可用一種基本無熒光本底的小溝結合物——MGB，取代了常規可發光的TAMRA熒光標記，使得新探針技術的熒光本底大大降低，從而提高分辨率）。當PCR反應在退火階段時，一對引物和一條探針同時與目的基因片段結合，此時探針上R基團發出的熒光信號被Q基團所吸收，儀器檢測不到R所發出的熒光信號；當PCR反應進行到延伸階段時，Taq酶在引物的引導下，以四種核苷酸爲底物，根據鹼基配對的原則，沿着模板鏈合成新鏈；當鏈的延伸進行到探針結合部位時，受到探針的阻礙而無法繼續，此時的Taq酶發揮它的5′→3′外切核酸酶的功能，將探針水解成單核苷酸，消除阻礙，與此同時標記在探針上的R基團遊離出來，R所發出的熒光再不爲Q所吸收而被檢測儀所接收；在Taq酶的作用下繼續延伸過程合成完整的新鏈，R和Q基團均遊離於溶液中，儀器可繼續檢測到R所發出的熒光信號。
8.4.2 B.4.2 材料及方法
8.4.3 B.4.2.1 設備
移液器（10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL）及配套吸頭、離心管（1.5mL、0.2mL）及管架、臺式高速離心機、普通冰箱、旋渦混合器、實時熒光PCR儀等。
8.4.4 B.4.2.2 試劑
引物及探針（見表B.2）、RNA提取試劑、熒光RT-PCR試劑盒等。
表B.2 引物及探針類型
引物 | 序列(5'→3') | 基因組位置 | 熒光標記 | 型特異性 |
Den-FP | GCATATTGACGCTGGGAGAGA | 10611 | ||
Den-RP | GGCGTTCTGTGCCTGGAAT | 10683 | 通用 | |
Den-PP | CAGAGATCCTGCTGTCTC | 10642 | FAM/MGB | |
Den-lF | CAA AAG GAA GTC GTG CAA TA | 8973 | ||
Den-lC | CTG AGT GAA TTC TCT CTA CTG AAC C | 9084 | I型 | |
Den-lP | CAT GTG GTT GGG AGC ACG C | 8998 | FAM/BHQ-1 | |
Den-2F | CAG GTT ATG GCA CTG TCA CGA T | 1443 | ||
Den-2C | CCA TCT GCA GCA ACA CCA TCT C | 1518 | II型 | |
Den-2P | CTC TCC GAG AAC AGG CCT CGA CTT CAA | 1469 | HEX/BHQ-1 | |
Den-3F | GGA CTG GAC ACA CGC ACT CA | 740 | ||
Den-3C | CAT GTC TCT ACC TTC TCG ACT TGT CT | 813 | Ⅲ型 | |
Den-3P | ACC TGG ATG TCG GCT GAA GGA GCT TG | 762 | TesasRed/BHQ-2 | |
Den-4F | TTG TCC TAA TGA TGC TGG TCG | 904 | ||
Den-4C | TCC ACC TGA GAC TCC TTC CA | 992 | Ⅳ型 | |
Den-4P | TTC CTA CTC CTA CGC ATC GCA TTC CG | 960 | Cy5/BHQ-3 |
8.4.5 B.4.3 檢測步驟
8.4.5.1 B.4.3.1 病毒RNA的提取
待檢標本用RNA提取試劑提取病毒RNA，按照試劑說明進行操作，製備模板RNA。
8.4.5.2 B.4.3.2 登革病毒4種血清型通用熒光PCR擴增
用登革病毒通用引物和探針進行熒光PCR擴增。以ABI 7500熒光PCR儀爲例，反應條件可根據使用的試劑說明進行調整，如：42℃ 30min，95℃ 10min後，進行45個循環的二步法PCR：95℃ 15s→62℃ 40s，熒光信號的收集設置在每次循環的退火延伸時進行。
8.4.5.3 B.4.3.3 登革病毒4種血清型分型熒光PCR擴增
分別以登革病毒4種血清型特異的引物和探針進行熒光PCR擴增。以ABI 7500熒光PCR儀爲例，反應條件可根據使用的試劑說明進行調整，如：42℃ 30min，95℃ 10min後，進行45個循環的二步法PCR：95℃ 15s→60℃ 60s，熒光信號的收集設置在每次循環的退火延伸時進行。
8.4.6 B.4.4 結果判斷
以熒光PCR反應的前3個～15個循環的熒光信號作爲熒光本底信號，以本底信號標準差的10倍作爲熒光閾值，標本擴增產生的熒光信號達到熒光閾值時所對應的循環數爲循環閾值（Ct值），以Ct＜40、熒光信號數據線性化處理後對應循環數生成的曲線圖呈“S”形的標本可判斷爲相應的登革病毒核酸檢測陽性。
8.4.7 B.4.5 意義
9 附錄C（資料性附錄）登革熱的鑑別診斷
9.1 C.1 麻疹
發熱、咳嗽、流涕、結膜充血、畏光，口腔內有Koplik斑，發熱第3天～第4天出現麻疹性皮疹。
9.2 C.2 風疹
9.3 C.3 猩紅熱
9.4 C.4 流行性感冒
發熱、咳嗽，無皮疹，全身中毒症狀較重，特別是短時間內出現數量較多的相似患者。
9.5 C.5 基孔肯雅熱
發熱、皮疹、關節痛、白細胞減少等表現，但病情一般較輕，常發生對稱性小關節炎。鑑別主要有賴於核酸檢測、病毒分離和血清學試驗。
9.6 C.6 寨卡病毒病
發熱、皮疹、結膜炎、神經系統損害等表現，可導致新生兒小頭畸形。鑑別主要有賴於核酸檢測、病毒分離和血清學試驗。
9.7 C.7 鉤端螺旋體病
有疫水接觸史，發熱、腓腸肌痛壓痛，淋巴結腫大，肝腎損害明顯，白細胞增多，鉤體血清學反應陽性。
9.8 C.8 腎綜合徵出血熱
有鼠類接觸史，發熱、充血出血、休克和急性腎功能損害等表現，白細胞增多，尿蛋白陽性，特異性IgM陽性。
9.9 C.9 恙蟲病
10 附錄D（資料性附錄）登革熱的病原學、流行病學及臨牀表現
10.1 D.1 病原學
登革病毒歸屬於黃病毒科黃病毒屬。成熟病毒顆粒由核衣殼蛋白和脂質膜蛋白形成一個立體結構，直徑約爲50nm。登革病毒爲RNA病毒，基因組由單股正鏈RNA組成，全長大約11000個核苷酸，包括編碼3個結構蛋白和和7個非結構蛋白的基因，3個結構蛋白爲核衣殼蛋白C、膜相關蛋白M和包膜蛋白E，包膜蛋白E與病毒的血凝活性及中和活性有關。登革病毒可分爲4種血清型：DEN-1，DEN-2，DEN-3和DEN-4，4種血清型登革病毒均可引起登革熱的發生和流行。
登革病毒對熱敏感。50℃30min或54℃ 10min、超聲波、紫外線、0.05％甲醛溶液、乳酸、高錳酸鉀、龍膽紫等均可滅活病毒。病毒在pH7～9環境中最爲穩定，在－70℃或冷凍乾燥狀態下可長期存活。在4℃條件下，患者急性期血清的感染性可保持數週之久。
10.2 D.2 流行病學
10.2.1 D.2.1 傳染源
登革熱患者、隱性感染者、帶病毒的非人靈長類動物是登革熱的主要傳染源。
10.2.2 D.2.2 傳播途徑
主要是經媒介伊蚊叮咬吸血傳播。在我國傳播媒介主要爲白紋伊蚊和埃及伊蚊。
10.2.3 D.2.3 人羣易感性
人羣普遍易感，但感染後僅有部分人發病。感染登革病毒後，人體會對同型病毒產生持久的免疫，但對不同型病毒感染不能形成有效保護。再次感染不同型別登革病毒會引發非中和性交叉反應抗體增加，引起抗體依賴性增強感染（antibody-dependent enhancement，ADE），這是引起重症登革熱機制的一個重要假設。
10.2.4 D.2.4 流行特徵
登革熱流行於全球熱帶及亞熱帶地區，尤其是在東南亞、太平洋島嶼和加勒比海等100多個國家和地區。我國各省均有輸入病例報告，廣東、雲南、海南、福建、廣西、浙江等南方省份可發生本地登革熱暴發或流行，登革熱在熱帶、亞熱帶地域可常年發病，在我國輸入病例常年存在，本地感染病例一般於夏秋季高發。
10.3 D.3 臨牀表現
10.3.1 D.3.1 臨牀分型
登革熱是一種全身性疾病，臨牀表現複雜多樣。根據病情嚴重程度，臨牀可分爲普通登革熱和重症登革熱兩種類型。
10.3.2 D.3.2 臨牀分期
10.3.2.1 D.3.2.1 急性發熱期
登革熱的臨牀表現複雜多樣，潛伏期1 d～14 d，一般5 d～9 d。其特徵爲突起發病，發熱是最常見的症狀，24h體溫可達39℃以上，一般持續3 d～7d。部分病例於發熱3 d～5d後，體溫降至正常1 d～3d後再次升高，表現爲“雙峯熱”。發熱時多伴頭痛，全身肌肉、骨骼和關節痛，明顯乏力，可出現噁心、嘔吐、腹瀉、食慾不振等消化道症狀。病程第3天～第6天全身出現充血性皮疹或點狀出血疹等，典型皮疹多見於四肢的針尖樣出血點及“皮島”樣表現。部分病例皮疹伴有皮膚瘙癢。部分病人可出現不同程度的出血表現，如皮下出血、注射部位瘀點瘀斑、牙齦出血、鼻衄及束臂試驗陽性等。
10.3.2.2 D.3.2.2 極期
部分患者高熱持續不緩解，或退熱後病情加重，可因毛細血管通透性增加導致明顯的血漿滲漏。嚴重者可發生休克及其他重要臟器損傷等。
極期通常出現在病程的第3天～第8天。
部分患者持續高熱，或熱退後病情加重，出現腹部劇痛、持續嘔吐等重症預警指徵往往提示極期的開始。極期可因全身毛細血管通透性增加導致球結膜水腫，四肢非凹陷型水腫，胸水、腹水、心包積液、膽囊壁增厚、低蛋白血症等血漿滲漏表現，嚴重者可發生休克及重要臟器損傷等表現。
少數患者無明顯的血漿滲漏表現，但仍可出現嚴重出血包括皮膚瘀斑、嘔血、黑便、陰道流血、肉眼血尿、顱內出血等。
10.3.2.3 D.3.2.3 恢復期
極期後的2 d～3d，患者病情好轉，胃腸道症狀減輕，進入恢復期。部分患者可見針尖樣出血點，下肢多見，可有皮膚瘙癢。白細胞計數開始上升，血小板計數逐漸恢復。
多數患者表現爲普通登革熱，可僅有發熱期和恢復期。少數患者發展爲重症登革熱。
10.4 D.4 重症登革熱
10.4.1 D.4.1 重症登革熱的高危人羣
具體人羣如下：
a) 老人、嬰幼兒和孕婦；
b) 伴有糖尿病、高血壓、冠心病、消化性潰瘍、哮喘、慢性腎病等基礎疾病者；
c) 伴有免疫缺陷病者。
10.4.2 D.4.2 早期識別重症登革熱的預警指徵
具體指徵如下：
a) 退熱後病情惡化；
b) 嚴重腹部疼痛；
c) 持續嘔吐；
d) 昏睡或煩躁不安；
f) 血小板計數＜50×109/L；
g) 白蛋白＜35g/L。
10.5 D.5 束臂試驗
又稱爲毛細血管脆性試驗。在前臂屈側肘彎下4 cm處畫一直徑5 cm的圓圈，用血壓計袖帶束於該側上臂，先測定血壓，然後使血壓保持在收縮壓和舒張壓之間，持續8 min後解除壓力。待皮膚顏色恢復正常時，計數圓圈內皮膚新的出血點數目。出血點超過10個爲束臂試驗陽性。
11 參考文獻
[1] Dengue Guidelines for Diagnosis,treatment,prevention and control.WHO,2009,1-160.
[2] Handbook for clinical management of dengue.WHO,2012,1-20.
[3] 登革熱診療指南(2014年第2版).國家衛生計生委，2014.
[4] WS 216—2008登革熱診斷標準.
[5] 羅會明.登革熱防治手冊[M].北京:中國標準出版社，2002.
[6] Goldman,Bennett總主編，王賢才總主譯，西氏內科學—傳染病[M]，第21版，世界圖書出版公司，2000，9:543-550.
[7] Simmons CP,Ffarrar JJ,Chan NV,et al.Dengue[J].N Engl J Med,2012,366:1423-1432.
[8] 張復春，楊智聰.登革熱[M].北京:北京科技出版社，2008.
[9] 應若素等.廣東省2014年登革熱暴發流行的臨牀和實驗室特點[J].中華傳染病雜誌，2014(第12期).
[10] 廣東省重症登革熱診療指引(2014年第1版).廣東省衛生計生委，2014.
[11] 方美玉，林立輝，劉建偉.蟲媒傳染病[M].北京:軍事醫學科學出版社，2005.
[12] Andrew Rhodes,Laura E.Evans,Waleed Alhazzani,et al.Surviving Sepsis Campaign:InternationalGuidelines for Management of Sepsis and Septic Shock: 2016[J].Intensive Care Medicine,2017,43:304–377.
13 解讀
《登革熱診斷標準（WS 216-2008)》於2008年發佈，作爲診斷登革熱的依據，爲該病的防治發揮了重要作用。近年來，登革熱病例病原學早期快速診斷、臨牀表現、疾病轉歸、病例管理的研究取得很大進展。快速、特異、敏感的實驗室診斷方法可以使用簡單的儀器設備在短短的幾個小時內檢測出結果。近年來，世界衛生組織對登革熱的嚴重性診斷提出了全新的分類，提出重症登革熱的概念，方便臨牀管理。基於以上情況，結合當前登革熱熱流行病學、臨牀診斷與治療、實驗室檢測技術最新進展，對登革熱診斷標準進行修訂。
本次修訂增加發病5天內的登革病毒NS1抗原檢測陽性作爲臨牀診斷的指標之一。主要依據：世界衛生組織《登革熱診斷，治療和防控指引（2009）》中指出，登革病毒NS1抗原在初次和二次感染的病人血清裏以免疫複合物的形式存在，在疾病的早期具有較高的濃度，發病後9天內可以仍然可以檢測到，較核酸檢測時間長。世界衛生組織2012年發佈的《登革熱臨牀管理手冊》中已經將檢測到登革病毒NS1抗原作爲登革熱實驗確診的依據之一。世界衛生組織在《登革熱防控全球戰略（2012-2020）》中再次指出，登革病毒NS1抗原快速檢測可以作爲登革熱的常規檢測方法，可以在初級衛生保健中心，區域中心和參比中心開展檢測。目前， 國外已有多個商品化試劑盒用於檢測登革病毒的NS1抗原。
將原標準臨牀診斷病例中“登革出血熱”和“登革休克綜合徵”刪除，新增加“重症登革熱”條目，其臨牀表現的內容也相應進行修改，調整爲“具備嚴重出血、重要臟器嚴重損傷、休克中任一項。” 增加重症登革熱的高危人羣和早期識別重症登革熱的預警指徵。主要依據爲：2009年世界衛生組織出版了《登革熱：診斷、治療、預防控制指南》，對登革熱的嚴重性診斷提出了全新的分類，提出重症登革熱的概念，將“登革出血熱”和“登革熱休克綜合徵”重新整合，方便臨牀管理。