1 拼音
2010nián bǎn yào diǎn èr bù fù lù Ⅴ
色譜法根據其分離原理可分爲：吸附色譜法、分配色譜法、離子交換色譜法與排阻色譜法等。吸附色譜法是利用被分離物質在吸附劑上吸附能力的不同，用溶劑或氣體洗脫使組分分離；常用的吸附劑有氧化鋁、硅膠、聚酰胺等有吸附活性的物質。分配色譜法是利用被分離物質在兩相中分配係數的不同使組分分離，其中一相被塗布或鍵合在固體載體上，稱爲固定相，另一相爲液體或氣體，稱爲流動相；常用的載體有硅膠、硅藻土、硅鎂型吸附劑與纖維素粉等。離子交換色譜法是利用被分離物質在離子交換樹脂上交換能力的不同使組分分離；常用的樹脂有不同強度的陽離子交換樹脂、陰離子交換樹脂，流動相爲水或含有機溶劑的緩衝液。分子排阻色譜法又稱凝膠色譜法，是利用被分離物質分子大小的不同導致在填料上滲透程度不同使組分分離；常用的填料有分子篩、葡聚糖凝膠、微孔聚合物、微孔硅膠或玻璃珠等，根據固定相和供試品的性質選用水或有機溶劑作爲流動相。
色譜法又可根據分離方法分爲：紙色譜法、薄層色譜法、柱色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法等。所用溶劑應與供試品不起化學反應，純度要求較高。分離時的溫度，除氣相色譜法或另有規定外，係指在室溫操作。分離後各成分的檢測，應採用各品種項下所規定的方法。採用紙色譜法、薄層色譜法或柱色譜法分離有色物質時，可根據其色帶進行區分；分離無色物質時，可在短波（254nm）或長波（365nm）紫外光燈下檢視，其中紙色譜或薄層色譜也可噴以顯色劑使之顯色，或在薄層色譜中用加有熒光物質的薄層硅膠，採用熒光猝滅法檢視。柱色譜法、氣相色譜法和高效液相色譜法可用接於色譜柱出口處的各種檢測器檢測。柱色譜法還可分部收集流出液後用適宜方法測定。
2 附錄Ⅴ A 紙色譜法
紙色譜法系以紙爲載體，以紙上所含水分或其他物質爲固定相，用展開劑進行展開的分配色譜。供試品經展開後，可用比移值（Rf）表示其各組成成分的位置（比移值=原點中心至斑點中心的距離／原點中心至展開劑前沿的距離）。由於影響比移值的因素較多，因而一般採用在相同實驗條件下與對照物質對比以確定其異同。用作藥品鑑別時，供試品在色譜圖中所顯主斑點的位置與顏色（或熒光），應與對照品在色譜圖中所顯主斑點相同。用作藥品純度檢查時，可取一定量的供試品，經展開後，按各品種項下的規定，檢視其所顯雜質斑點的個數或呈色深度（或熒光強度）。進行藥品含量測定時，將色譜主斑點剪下經洗脫後，再用適宜的方法測定。
2.1 1．儀器與材料
（1）展開容器 通常爲圓形或長方形玻璃缸，缸上具有磨口玻璃蓋，應能密閉。用於下行法時，蓋上有孔，可插入分液漏斗，用以加入展開劑。在近頂端有一用支架架起的玻璃槽作爲展開劑的容器，槽內有一玻棒，用以壓住色譜濾紙；槽的兩側各支一玻棒，用以支持色譜濾紙使其自然下垂。用於上行法時，在蓋上的孔中加塞，塞中插入玻璃懸鉤，以便將點樣後的色譜濾紙掛在鉤上；併除去溶劑槽和支架。
（2）點樣器 常用具支架的微量注射器或定量毛細管，應能使點樣位置正確、集中。
（3）色譜濾紙 應質地均勻平整，具有一定機械強度，不含影響展開效果的雜質；也不應與所用顯色劑起作用，以免影響分離和鑑別效果，必要時可進行處理後再用。用於下行法時，取色譜濾紙按纖維長絲方向切成適當大小的紙條，離紙條上端適當的距離（使色譜濾紙上端能足夠浸入溶劑槽內的展開劑中，並使點樣基線能在溶劑槽側的玻璃支持棒下數釐米處）用鉛筆劃一點樣基線，必要時，可在色譜濾紙下端切成鋸齒形便於展開劑滴下。用於上行法時，色譜濾紙長約25cm，寬度則按需要而定，必要時可將色譜濾紙捲成筒形；點樣基線距底邊約2.5cm。
2.2 2．操作方法
（1）下行法 將供試品溶解於適宜的溶劑中製成一定濃度的溶液。用定量毛細管或微量注射器吸取溶液，點於點樣基線上，溶液宜分次點加，每次點加後，俟其自然乾燥、低溫烘乾或經溫熱氣流吹乾，樣點直徑爲2～4mm，點間距離約爲1.5～2.0cm，樣點通常應爲圓形。
將點樣後的色譜濾紙的點樣端放在溶劑槽內並用玻棒壓住，使色譜濾紙通過槽側玻璃支持棒自然下垂，點樣基線在支持棒下數釐米處。展開前，展開缸內用各品種項下規定的溶劑的蒸氣使之飽和，一般可在展開缸底部放一裝有規定溶劑的平皿或將被規定溶劑潤溼的濾紙條附着在展開缸內壁上，放置一定時間，俟溶劑揮發使缸內充滿飽和蒸氣。然後小心添加展開劑至溶劑槽內，使色譜濾紙的上端浸沒在槽內的展開劑中。展開劑即經毛細管作用沿色譜濾紙移動進行展開，展開至規定的距離後，取出色譜濾紙，標明展開劑前沿位置，俟展開劑揮散後按規定方法檢測色譜斑點。
（2）上行法 點樣方法同下行法。展開缸內加入展開劑適量，放置俟展開劑蒸氣飽和後，再下降懸鉤，使色譜濾紙浸入展開劑約0.5cm，展開劑即經毛細管作用沿色譜濾紙上升，除另有規定外，一般展開至約15cm後，取出晾乾，按規定方法檢視。
展開可以單向展開，即向一個方向進行；也可進行雙向展開，即先向一個方向展開，取出，俟展開劑完全揮發後，將濾紙轉動90°，再用原展開劑或另一種展開劑進行展開；亦可多次展開、連續展開或徑向展開等。
3 附錄Ⅴ B 薄層色譜法
薄層色譜法系將供試品溶液點樣於薄層板上，經展開、檢視後所得的色譜圖，與適宜的對照物按同法所得的色譜圖作對比，用於藥品的鑑別或雜質檢查的方法。
3.1 1．儀器與材料
（1）薄層板
自制薄層板 除另有規定外，玻璃板要求光滑、平整，洗淨後不附水珠，晾乾。最常用的固定相有硅膠G、硅膠GF254、硅膠H和硅膠HF254，其次有硅藻土、硅藻土G、氧化鋁、氧化鋁G、微晶纖維素、微晶纖維素F254等。其顆粒大小，一般要求粒徑爲5～40μm。
薄層塗布，一般可分爲無黏合劑和含黏合劑兩種。前者系將固定相直接塗布於玻璃板上，後者系在固定相中加入一定量的黏合劑，一般常用10%～15%煅石膏（CaSO4·2H2O在140℃加熱4小時），混勻後加水適量使用，或用羧甲基纖維素鈉水溶液（0.2%～0.5%）適量調成糊狀，均勻塗布於玻璃板上。使用塗布器塗布應能使固定相在玻璃板上塗成一層符合厚度要求的均勻薄層。
市售薄層板 分普通薄層板和高效薄層板，如硅膠薄層板、硅膠GF254薄層板、聚酰胺薄膜和鋁基片薄層板等。高效薄層板的粒徑一般爲5～7μm。
（2）點樣器 同紙色譜法項下。
（3）展開容器 應使用適合薄層板大小的玻璃制薄層色譜展開缸，並有嚴密的蓋子，底部應平整光滑，或有雙槽。
（4）顯色劑 見各品種項下的規定。可採用噴霧顯色、浸漬顯色或置適宜試劑的蒸氣中燻蒸顯色，用以檢出斑點。
（5）顯色裝置 噴霧顯色要求用壓縮氣體使顯色劑呈均勻
細霧狀噴出；浸漬顯色可用專用玻璃器皿或用適宜的玻璃缸代替；蒸氣燻蒸顯色可用雙槽玻璃缸或適宜大小的乾燥器代替。
（6）檢視裝置 爲裝有可見光、短波紫外光（254nm）、長波紫外光（365nm）光源及相應濾片的暗箱，可附加攝像設備供拍攝色譜用，暗箱內光源應有足夠的光照度。
3.2 2．操作方法
（1）薄層板製備
自制薄層板 除另有規定外，將1份固定相和3份水在研鉢中按同一方向研磨混合，去除表面的氣泡後，倒入塗布器中，在玻璃板上平穩地移動塗布器進行塗布（厚度爲0.2～0.3mm），取下塗好薄層的玻璃板，置水平臺上於室溫下晾乾後，在110℃活化30分鐘，即置有乾燥劑的乾燥箱中備用。使用前檢查其均勻度（可通過透射光和反射光檢視）。
市售薄層板 臨用前一般應在110℃活化30分鐘。聚酰胺薄膜不需活化。鋁基片薄層板可根據需要剪裁，但須注意剪裁後的薄層板底邊的硅膠層不得有破損。如在貯放期間被空氣中雜質污染，使用前可用適宜的溶劑在展開容器中上行展開預洗，110℃活化後，置乾燥器中備用。
（2）點樣 除另有規定外，用點樣器點樣於薄層板上，一般爲圓點，點樣基線距底邊2.0cm，樣點直徑爲2～4mm（高效薄層板爲1～2mm），點間距離可視斑點擴散情況以不影響檢出爲宜，一般爲1.0～2.0cm（高效薄層板可不小於5mm）。點樣時必須注意勿損傷薄層板表面。
（3）展開 展開缸如需預先用展開劑飽和，可在缸中加入足夠量的展開劑，必要時在壁上貼兩條與缸一樣高、寬的濾紙條，一端浸入展開劑中，密封頂蓋，使系統平衡或按各品種項下的規定操作。
將點好供試品的薄層板放入展開缸中，浸入展開劑的深度爲距薄層板底邊0.5～1.0cm（切勿將樣點浸入展開劑中），密封頂蓋，待展開至適宜的展距（如：20cm的薄層板，展距一般爲10～15cm；10cm的高效薄層板，展距一般爲5cm左右），取出薄層板，晾乾，按各品種項下的規定檢測。
展開可以單向展開，即向一個方向進行；也可以進行雙向展開，即先向一個方向展開，取出，待展開劑完全揮發後，將薄層板轉動90°，再用原展開劑或另一種展開劑進行展開；亦可多次展開。
（4）顯色與檢視 熒光薄層板可用熒光猝滅法；普通薄層板，有色物質可直接檢視，無色物質可用物理或化學方法檢視。物理方法是檢出斑點的熒光顏色及強度；化學方法一般用化學試劑顯色後，立即覆蓋同樣大小的玻璃板，檢視。
3.3 3．系統適用性試驗
按各品種項下要求對檢測方法進行系統適用性試驗，使斑點的檢測靈敏度、比移值（Rf）和分離效能符合規定。
（1）檢測靈敏度 係指雜質檢查時，供試品溶液中被測物質能被檢出的最低量。一般採用對照溶液稀釋若干倍的溶液與供試品溶液和對照溶液在規定的色譜條件下，在同一塊薄層板上點樣、展開、檢視，前者應顯示清晰的斑點。
（2）比移值（Rf） 係指從基線至展開斑點中心的距離與從基線至展開劑前沿的距離的比值。鑑別時，可用供試品溶液主斑點與對照品溶液主斑點的比移值進行比較，或用比移值來說明主斑點或雜質斑點的位置。
除另有規定外，比移值（Rf）應在0.2～0.8之間。
（3）分離效能 鑑別時，在對照品與結構相似藥物的對照品製成混合對照溶液的色譜圖中，應顯示兩個清晰分離的斑點。雜質檢查的方法選擇時，可將雜質對照品用供試品自身稀釋對照溶液溶解製成混合對照溶液，也可將雜質對照品用待測組分的對照品溶液溶解製成混合對照溶液，還可採用供試品以適當的降解方法獲得的溶液，上述溶液點樣展開後的色譜圖中，應顯示兩個清晰分離的斑點。
3.4 4．測定法
（1）鑑別 可採用與同濃度的對照品溶液，在同一塊薄層板上點樣、展開與檢視，供試品溶液所顯主斑點的顏色（或熒光）與位置（Rf）應與對照品溶液的主斑點一致，而且主斑點的大小與顏色的深淺也應大致相同。或採用供試品溶液與對照品溶液等體積混合，應顯示單一、緊密的斑點；或選用與供試品化學結構相似的藥物對照品與供試品溶液的主斑點比較，兩者Rf應不同，或將上述兩種溶液等體積混合，應顯示兩個清晰分離的斑點。
（2）雜質檢查 可採用雜質對照品法、供試品溶液的自身稀釋對照法，或兩法並用。供試品溶液除主斑點外的其他斑點應與相應的雜質對照品溶液或系列濃度雜質對照品溶液的相應主斑點比較，或與供試品溶液的自身稀釋對照溶液或系列濃度自身稀釋對照溶液的相應主斑點比較，不得更深。
4 附錄Ⅴ C 柱色譜法
4.1 1．吸附柱色譜
色譜柱爲內徑均勻、下端（帶或不帶活塞）縮口的硬質玻璃管，端口或活塞上部鋪墊適量棉花或玻璃纖維，管內裝入吸附劑。吸附劑的顆粒應儘可能大小均勻，以保證良好的分離效果。除另有規定外，通常採用直徑爲0.07～0.15mm的顆粒。色譜柱的大小，吸附劑的品種和用量，以及洗脫時的流速，均按各品種項下的規定。
4.1.1 （1）吸附劑的填裝
①幹法 將吸附劑一次加入色譜柱，振動管壁使其均勻下沉，然後沿管壁緩緩加入洗脫劑；若色譜柱本身不帶活塞，可在色譜柱下端出口處連接活塞，加入適量的洗脫劑，旋開活塞使洗脫劑緩緩滴出，然後自管頂緩緩加入吸附劑，使其均勻地潤溼下沉，在管內形成鬆緊適度的吸附層。操作過程中應保持有充分的洗脫劑留在吸附層的上面。
②溼法 將吸附劑與洗脫劑混合，攪拌除去空氣泡，徐徐傾入色譜柱中，然後加入洗脫劑將附着在管壁的吸附劑洗下，使色譜柱面平整。
俟填裝吸附劑所用洗脫劑從色譜柱自然流下，至液麪和柱表面相平時，即加供試品溶液。
4.1.2 （2）供試品的加入
除另有規定外，將供試品溶於開始洗脫時使用的洗脫劑中，再沿管壁緩緩加入，注意勿使吸附劑翻起。或將供試品溶於適當的溶劑中，與少量吸附劑混勻，再使溶劑揮發去盡使呈鬆散狀，加在已製備好的色譜柱上面。如供試品在常用溶劑中不溶，可將供試品與適量的吸附劑在乳鉢中研磨混勻後加入。
4.1.3 （3）洗脫
除另有規定外，通常按洗脫劑洗脫能力大小遞增變換洗脫劑的品種和比例，分部收集流出液，至流出液中所含成分顯著減少或不再含有時，再改變洗脫劑的品種和比例。操作過程中應保持有充分的洗脫劑留在吸附層的上面。
4.2 2．分配柱色譜
方法和吸附柱色譜基本一致。裝柱前，先將固定液溶於適當溶劑中，加入適宜載體，混合均勻，待溶劑完全揮幹後分次移入色譜柱中並用帶有平面的玻棒壓緊；供試品可溶於固定液，混以少量載體，加在預製好的色譜柱上端。
5 附錄Ⅴ D 高效液相色譜法
高效液相色譜法系採用高壓輸液泵將規定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱，對供試品進行分離測定的色譜方法。注入的供試品，由流動相帶入柱內，各組分在柱內被分離，並依次進入檢測器，由積分儀或數據處理系統記錄和處理色譜信號。
5.1 1．對儀器的一般要求和色譜條件
所用的儀器爲高效液相色譜儀。儀器應定期檢定並符合有關規定。
5.1.1 （1）色譜柱
反相色譜系統使用非極性填充劑，常用的色譜柱填充劑爲化學鍵合硅膠，以十八烷基硅烷鍵合硅膠最爲常用，辛基硅烷鍵合硅膠和其他類型的硅烷鍵合硅膠（如氰基鍵合硅烷和氨基鍵合硅烷等）也有使用。正相色譜系統使用極性填充劑，常用的填充劑有硅膠等。離子交換色譜系統使用離子交換填充劑；分子排阻色譜系統使用凝膠或高分子多孔微球等填充劑；對映異構體的分離通常使用手性填充劑。填充劑的性能（如載體的形狀、粒徑、孔徑、表面積、鍵合基團的表面覆蓋度、含碳量和鍵合類型等）以及色譜柱的填充，直接影響供試品的保留行爲和分離效果。分析分子量小於2000的化合物應選擇孔徑在15nm（1nm=10A）以下的填料，分析分子量大於2000的化合物則應選擇孔徑在30nm以上的填料。除另有規定外，普通分析柱的填充劑粒徑一般在3～10μm之間，粒徑更小（約2μm）的填充劑常用於填裝微徑柱（內徑約2mm）。
使用微徑柱時，輸液泵的性能、進樣體積、檢測池體積和系統的死體積等必須與之匹配；如有必要，色譜條件也需作適當的調整。當對其測定結果產生爭議時，應以品種項下規定的色譜條件的測定結果爲準。
以硅膠爲載體的鍵合固定相的使用溫度通常不超過40℃，爲改善分離效果可適當提高色譜柱的使用溫度，但不宜超過60℃。
流動相的pH值應控制在2～8之間。當pH值大於8時，可使載體硅膠溶解；當pH值小於2時，與硅膠相連的化學鍵合相易水解脫落。當色譜系統中需使用pH值大於8的流動相時，應選用耐鹼的填充劑，如採用高純硅膠爲載體並具有高表面覆蓋度的鍵合硅膠填充劑、包覆聚合物填充劑、有機一無機雜化填充劑或非硅膠基鍵合填充劑等；當需使用pH值小於2的流動相時，應選用耐酸的填充劑，如具有大體積側鏈能產生空間位阻保護作用的二異丙基或二異丁基取代十八烷基硅烷鍵合硅膠填充劑、有機－無機雜化填充劑等。
5.1.2 （2）檢測器
最常用的檢測器爲紫外檢測器，包括二極管陣列檢測器，其他常見的檢測器有熒光檢測器、蒸發光散射檢測器、示差折光檢測器、電化學檢測器和質譜檢測器等。
紫外、熒光、電化學檢測器爲選擇性檢測器，其響應值不僅與供試品溶液的濃度有關，還與化合物的結構有關；蒸發光散射檢測器和示差折光檢測器爲通用型檢測器，對所有的化合物均有響應；蒸發光散射檢測器對結構類似的化合物，其響應值幾乎僅與供試品的質量有關；二極管陣列檢測器可以同時記錄供試品的吸收光譜，故可用於供試品的光譜鑑定和色譜峯的純度檢查。
紫外、熒光、電化學和示差折光檢測器的響應值與供試品溶液的濃度在一定範圍內呈線性關係，但蒸發光散射檢測器的響應值與供試品溶液的濃度通常呈指數關係，故進行計算時，一般需經對數轉換。
不同的檢測器，對流動相的要求不同。如採用紫外檢測器，所用流動相應符合紫外－可見分光光度法（2010年版藥典二部附錄ⅣA）項下對溶劑的要求；採用低波長檢測時，還應考慮有機相中有機溶劑的截止使用波長，並選用色譜級有機溶劑。蒸發光散射檢測器和質譜檢測器通常不允許使用含不揮發性鹽組分的流動相。
5.1.3 （3）流動相
反相色譜系統的流動相首選甲醇－水系統（採用紫外末端波長檢測時，首選乙腈－水系統），如經試用不適合時，再選用其他溶劑系統。應儘可能少用含有緩衝液的流動相，必須使用時，應儘可能選用含較低濃度緩衝液的流動相。由於C18鏈在水相環境中不易保持伸展狀態，故對於十八烷基硅烷鍵合硅膠爲固定相的反相色譜系統，流動相中有機溶劑的比例通常應不低於5%，否則C18鏈的隨機捲曲將導致組分保留值變化，造成色譜系統不穩定。
各品種項下規定的條件除固定相種類、流動相組分、檢測器類型不得改變外，其餘如色譜柱內徑、長度、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組分的比例、柱溫、進樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當改變，以適應供試品並達到系統適用性試驗的要求。其中，調整流動相組分比例時，以組分比例較低者（小於或等於50%）相對於自身的改變量不超過±30%且相對於總量的改變量不超過±10%爲限，如30%相對改變量的數值超過總量的10%時，則改變量以總量的±10%爲限。
對於必須使用特定牌號的填充劑方能滿足分離要求的品種，可在該品種項下注明。
5.2 2．系統適用性試驗
色譜系統的適用性試驗通常包括理論板數、分離度、重複性和拖尾因子等四個參數。其中，分離度和重複性尤爲重要。
按各品種項下要求對色譜系統進行適用性試驗，即用規定的對照品溶液或系統適用性試驗溶液在規定的色譜系統進行試驗，必要時，可對色譜系統進行適當調整，以符合要求。
5.2.1 （1）色譜柱的理論板數（n）
用於評價色譜柱的分離效能。由於不同物質在同一色譜柱上的色譜行爲不同，採用理論板數作爲衡量柱效能的指標時，應指明測定物質，一般爲待測組分或內標物質的理論板數。
在規定的色譜條件下，注入供試品溶液或各品種項下規定的內標物質溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分峯或內標物質峯的保留時間tR（以分鐘或長度計，下同，但應取相同單位）和峯寬（W）或半高峯寬（Wh/2），按n=16（tR/W）2或n=5.54（tR/Wh/2）2計算色譜柱的理論板數。
5.2.2 （2）分離度（R）
用於評價待測組分與相鄰共存物或難分離物質之間的分離程度，是衡量色譜系統效能的關鍵指標。可以通過測定待測物質與已知雜質的分離度，也可以通過測定待測組分與某一添加的指標性成分（內標物質或其他難分離物質）的分離度，或將供試品或對照品用適當的方法降解，通過測定待測組分與某一降解產物的分離度，對色譜系統進行評價與控制。
無論是定性鑑別還是定量分析，均要求待測峯與其他峯、內標峯或特定的雜質對照峯之間有較好的分離度。除另有規定外，待測組分與相鄰共存物之間的分離度應大於1.5。分離度的計算公式爲：
式中tR2爲相鄰兩峯中後一峯的保留時間；tR1爲相鄰兩峯中前一峯的保留時間；W1、W2及W1,h/2、W2,h/2分別爲此相鄰兩峯的峯寬及半高峯寬（如圖）。
當對測定結果有異議時，色譜柱的理論板數（n）和分離度（R）均以峯寬（W）的計算結果爲準。
5.2.3 （3）重複性
用於評價連續進樣中，色譜系統響應值的重複性能。採用外標法時，通常取各品種項下的對照品溶液，連續進樣5次，除另有規定外，其峯面積測量值的相對標準偏差應不大於2.0%；採用內標法時，通常配製相當於80%、100%和120%的對照品溶液，加入規定量的內標溶液，配成3種不同濃度的溶液，分別至少進樣2次，計算平均校正因子。其相對標準偏差應不大於2.0%。
5.2.4 （4）拖尾因子（T）
用於評價色譜峯的對稱性。爲保證分離效果和測量精度，應檢查待測峯的拖尾因子是否符合各品種項下的規定。拖尾因子計算公式爲：
式中W0.05h爲5%峯高處的峯寬；
d1爲峯頂點至峯前沿之間的距離（如圖）。
除另有規定外，峯高法定量時T應在0.95～1.05之間。峯面積法測定時，若拖尾嚴重，將影響峯面積的準確測量。必要時，應在各品種項下對拖尾因子作出規定。
5.3 3．測定法
5.3.1 （1）內標法
按各品種項下的規定，精密稱（量）取對照品和內標物質，分別配成溶液，精密量取各適量，混合配成校正因子測定用的對照溶液。取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測量對照品和內標物質的峯面積或峯高，按下式計算校正因子：
式中 AS爲內標物質的峯面積或峯高；
AR爲對照品的峯面積或峯高；
cS爲內標物質的濃度；
cR爲對照品的濃度。
再取各品種項下含有內標物質的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測量供試品中待測成分和內標物質的峯面積或峯高，按下式計算含量：
式中AX爲供試品的峯面積或峯高；
cX爲供試品的濃度；
A'X爲內標物質的峯面積或峯高；
c'S爲內標物質的濃度；
f爲校正因子。
採用內標法，可避免因樣品前處理及進樣體積誤差對測定結果的影響。
5.3.2 （2）外標法
按各品種項下的規定，精密稱（量）取對照品和供試品，配製成溶液，分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品溶液和供試品溶液中待測成分的峯面積（或峯高），按下式計算含量：
式中各符號意義同上。
由於微量注射器不易精確控制進樣量，當採用外標法測定供試品中成分或雜質含量時，以定量環或自動進樣器進樣爲好。
5.3.3 （3）加校正因子的主成分自身對照法
測定雜質含量時，可採用加校正因子的主成分自身對照法。在建立方法時，按各品種項下的規定，精密稱（量）取雜質對照品和待測成分對照品各適量，配製測定雜質校正因子的溶液，進樣，記錄色譜圖，按上述（1）法計算雜質的校正因子。此校正因子可直接載入各品種項下，用於校正雜質的實測峯面積。這些需作校正計算的雜質，通常以主成分爲參照，採用相對保留時間定位，其數值一併載入各品種項下。
測定雜質含量時，按各品種項下規定的雜質限度，將供試品溶液稀釋成與雜質限度相當的溶液作爲對照溶液，進樣，調節檢測靈敏度（以噪聲水平可接受爲限）或進樣量（以柱子不過載爲限），使對照溶液的主成分色譜峯的峯高約達滿量程的10%～25%或其峯面積能準確積分[通常含量低於0.5%的雜質，峯面積的相對標準偏差（RSD）應小於10%;含量在0.5%～2%的雜質，峯面積的RSD應小於5%;含量大於2%的雜質，峯面積的RSD應小於2%]。然後，取供試品溶液和對照品溶液適量，分別進樣，供試品溶液的記錄時間，除另有規定外，應爲主成分色譜峯保留時間的2倍，測量供試品溶液色譜圖上各雜質的峯面積，分別乘以相應的校正因子後與對照溶液主成分的峯面積比較，依法計算各雜質含量。
5.3.4 （4）不加校正因子的主成分自身對照法
測定雜質含量時，若沒有雜質對照品，也可採用不加校正因子的主成分自身對照法。同上述（3）法配製對照溶液並調節檢測靈敏度後，取供試品溶液和對照溶液適量，分別進樣，前者的記錄時間，除另有規定外，應爲主成分色譜峯保留時間的2倍，測量供試品溶液色譜圖上各雜質的峯面積並與對照溶液主成分的峯面積比較，計算雜質含量。
若供試品所含的部分雜質未與溶劑峯完全分離，則按規定先記錄供試品溶液的色譜圖Ⅰ，再記錄等體積純溶劑的色譜圖Ⅱ。色譜圖Ⅰ上雜質峯的總面積（包括溶劑峯），減去色譜圖Ⅱ上的溶劑峯面積，即爲總雜質峯的校正面積。然後依法計算。
5.3.5 （5）面積歸一化法
按各品種項下的規定，配製供試品溶液，取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測量各峯的面積和色譜圖上除溶劑峯以外的總色譜峯面積，計算各峯面積佔總峯面積的百分率。
用於雜質檢查時，由於峯面積歸一化法測定誤差大，因此，通常只用於粗略考查供試品中的雜質含量。除另有規定外，一般不宜用於微量雜質的檢查。
6 附錄Ⅴ E 氣相色譜法
氣相色譜法系採用氣體爲流動相（載氣）流經裝有填充劑的色譜柱進行分離測定的色譜方法。物質或其衍生物氣化後，被載氣帶入色譜柱進行分離，各組分先後進入檢測器，用數據處理系統記錄色譜信號。
6.1 1．對儀器的一般要求
所用的儀器爲氣相色譜儀，由載氣源、進樣部分、色譜柱、柱溫箱、檢測器和數據處理系統等組成。進樣部分、色譜柱和檢測器的溫度均應根據分析要求適當設定。
6.1.1 （1）載氣源
氣相色譜法的流動相爲氣體，稱爲載氣，氦、氮和氫可用作載氣，可由高壓鋼瓶或高純度氣體發生器提供，經過適當的減壓裝置，以一定的流速經過進樣器和色譜柱；根據供試品的性質和檢測器種類選擇載氣，除另有規定外，常用載氣爲氮氣。
6.1.2 （2）進樣部分
進樣方式一般可採用溶液直接進樣、自動進樣或頂空迸樣。
溶液直接進樣採用微量注射器、微量進樣閥或有分流裝置的氣化室進樣；採用溶液直接進樣或自動進樣時，進樣口溫度應高於柱溫30～50℃；進樣量一般不超過數微升；柱徑越細，進樣量應越少，採用毛細管柱時，一般應分流以免過載。
頂空進樣適用於固體和液體供試品中揮發性組分的分離和測定。將固態或液態的供試品製成供試液後，置於密閉小瓶中，在恆溫控制的加熱室中加熱至供試品中揮發性組分在液態和氣態達到平衡後，由進樣器自動吸取一定體積的頂空氣注入色譜柱中。
6.1.3 （3）色譜柱
色譜柱爲填充柱或毛細管柱。填充柱的材質爲不鏽鋼或玻璃，內徑爲2～4mm，柱長爲2～4m，內裝吸附劑、高分子多孔小球或塗漬固定液的載體，粒徑爲0.18～0.25mm、0.15～0.18mm或0.125～0.15mm。常用載體爲經酸洗並硅烷化處理的硅藻土或高分子多孔小球，常用固定液有甲基聚硅氧烷、聚乙二醇等。毛細管柱的材質爲玻璃或石英，內壁或載體經塗漬或交聯固定液，內徑一般爲0.25mm、0.32mm或0.53mm，柱長5～60m，固定液膜厚0.1～5.0μm，常用的固定液有甲基聚硅氧烷、不同比例組成的苯基甲基聚硅氧烷、聚乙二醇等。
新填充柱和毛細管柱在使用前需老化處理，以除去殘留溶劑及易流失的物質，色譜柱如長期未用，使用前應老化處理，使基線穩定。
6.1.4 （4）柱溫箱
由於柱溫箱溫度的波動會影響色譜分析結果的重現性，因此柱溫箱控溫精度應在±1℃，且溫度波動小於每小時0.1℃。溫度控制系統分爲恆溫和程序升溫兩種。
6.1.5 （5）檢測器
適合氣相色譜法的檢測器有火焰離子化檢測器（FID）、熱導檢測器（TCD）、氮磷檢測器（NPD）、火焰光度檢測器（FPD）、電子捕獲檢測器（ECD）、質譜檢測器（MS）等。火焰離子化檢測器對碳氫化合物響應良好，適合檢測大多數的藥物；氮磷檢測器對含氮、磷元素的化合物靈敏度高；火焰光度檢測器對含磷、硫元素的化合物靈敏度高；電子捕獲檢測器適於含鹵素的化合物；質譜檢測器還能給出供試品某個成分相應的結構信息，可用於結構確證。除另有規定外，一般用火焰離子化檢測器，用氫氣作爲燃氣，空氣作爲助燃氣。在使用火焰離子化檢測器時，檢測器溫度一般應高於柱溫，並不得低於150℃，以免水汽凝結，通常爲250～350℃。
6.1.6 （6）數據處理系統
可分爲記錄儀、積分儀以及計算機工作站等。
各品種項下規定的色譜條件，除檢測器種類、固定液品種及特殊指定的色譜柱材料不得改變外，其餘如色譜柱內徑、長度、載體牌號、粒度、固定液塗布濃度、載氣流速、柱溫、進樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當改變，以適應具體品種並符合系統適用性試驗的要求。一般色譜圖約於30分鐘內記錄完畢。
6.2 2．系統適用性試驗
除另有規定外，應照高效液相色譜法（2010年版藥典二部附錄Ⅴ D）項下的規定。
6.3 3．測定法
（1）內標法（2）外標法（3）面積歸一化法
上述（1）～（3）法的具體內容均同高效液相色譜法（2010年版藥典二部附錄Ⅴ D）項下相應的規定。
（4）標準溶液加入法 精密稱（量）取某個雜質或待測成分對照品適量，配製成適當濃度的對照品溶液，取一定量，精密加入到供試品溶液中，根據外標法或內標法測定雜質或主成分含量，再扣除加入的對照品溶液含量，即得供試品溶液中某個雜質和主成分含量。
也可按下述公式進行計算，加入對照品溶液前後校正因子應相同，即：
則待測組分的濃度cX可通過如下公式進行計算：
式中cX爲供試品中組分X的濃度；
AX爲供試品中組分X的色譜峯面積；
△cX爲所加入的已知濃度的待測組分對照品的濃度；
Ais爲加入對照品後組分X的色譜峯面積。
由於氣相色譜法的進樣量一般僅數微升，爲減小進樣誤差，尤其當採用手工進樣時，由於留針時間和室溫等對進樣量也有影響，故以採用內標法定量爲宜；當採用自動進樣器時，由於進樣重複性的提高，在保證分析誤差的前提下，也可採用外標法定量。當採用頂空進樣時，由於供試品和對照品處於不完全相同的基質中，故可採用標準溶液加入法以消除基質效應的影響；當標準溶液加入法與其他定量方法結果不一致時，應以標準加入法結果爲準。
7 附錄Ⅴ F 電泳法
電泳法是指帶電荷的供試品（蛋白質、核苷酸等）在惰性支持介質（如紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等）中，在電場的作用下，向其對應的電極方向按各自的速度進行泳動，使組分分離成狹窄的區帶，用適宜的檢測方法記錄其電泳區帶圖譜並計算其含量（%）的方法。
7.1 第一法 紙電泳法
7.1.1 1．儀器裝置
包括電泳室及直流電源兩部分。
常用的水平式電泳室裝置如圖，包括兩個電泳槽A和一個可以密封的玻璃（或相應材料）蓋B;兩側的電泳槽均用有機玻璃（或相應材料）板C分成兩部分；外格裝有鉑電極（直徑0.5～0.8cm）D；裏格爲可放濾紙E的有機玻璃電泳槽架F，此架可從槽中取出；兩側電泳槽A內的鉑電極D經隔離導線穿過槽壁與電泳儀外接電源相連。
圖 水平式電泳室裝置
電源爲具有穩壓器的直流電源，常壓電泳一般在100～500V，高壓電泳一般在500～10000V。
7.1.2 2．操作法
（1）電泳緩衝液 枸櫞酸鹽緩衝液（pH3.0）：取枸櫞酸（C6H8O7·H2O） 39.04g與枸櫞酸鈉（C6H5Na3O7·2H2O）4.12g，加水4000ml，使溶解。
（2）濾紙 取色譜濾紙置1mol/L甲酸溶液中浸泡過夜，次日取出，用水漂洗至洗液的pH值不低於4，置60℃烘箱烘乾，備用。可按需要裁成長27cm、寬18cm的濾紙，或根據電泳室的大小裁剪，並在距底邊5～8cm處劃一起始線，每隔2.5～3cm做一點樣記號。
（3）點樣 有溼點法和幹點法。溼點法是將裁好的濾紙全部浸入枸櫞酸鹽緩衝液（pH3.0）中，溼潤後，取出，用濾紙吸乾多餘的緩衝液，置電泳槽架上，使起始線靠近陰極端，將濾紙兩端浸入緩衝液中，然後用微量注射器精密點加供試品溶液，每點10μl，共3點，並留2個空白位置。
幹點法是將供試品溶液點於濾紙上，吹乾，再點，反覆數次，直至點完規定量的供試品溶液，然後用噴霧器將濾紙噴溼，點樣處最後噴溼，本法適用於稀的供試品溶液。
（4）電泳 於電泳槽中加入適量電泳緩衝液，浸沒鉑電極，接通電泳儀穩壓電源檔，電壓梯度調整爲18～20V/cm，電泳約1小時45分鐘，取出，立即吹乾，置紫外光燈（254nm）下檢視，用鉛筆劃出紫色斑點的位置。
（5）含量測定 剪下供試品斑點和與斑點位置面積相近的空白濾紙，剪成細條，分別置試管中，各精密加入0.01mol/L鹽酸溶液5ml，搖勻，放置1小時，用3號垂熔玻璃漏斗濾過，也可用自然沉降或離心法傾取上清液，按各品種項下的規定測定吸光度，並計算含量。
7.2 第二法 醋酸纖維素薄膜電泳法
7.2.1 1．儀器裝置
7.2.2 2．試劑
（1）巴比妥緩衝液（pH8.6） 取巴比妥2.76g、巴比妥鈉15.45g，加水溶解使成1000ml。
（2）氨基黑染色液 取0.5g的氨基黑10B，溶於甲醇50ml、冰醋酸10ml及水40ml的混合液中。
（3）漂洗液 取乙醇45ml、冰醋酸5ml及水50ml，混勻。（4）透明液 取冰醋酸25ml，加無水乙醇75ml，混勻。
7.2.3 3．操作法
（1）醋酸纖維素薄膜 取醋酸纖維素薄膜，裁成2cm×8cm的膜條，將無光澤面向下，浸入巴比妥緩衝液（pH8.6）中，待完全浸透，取出夾於濾紙中，輕輕吸去多餘的緩衝液後，將膜條無光澤面向上，置電泳槽架上，經濾紙橋浸入巴比妥緩衝液（pH8.6）中。
（2）點樣與電泳 於膜條上距負極端2cm處，條狀滴加蛋白含量約5%的供試品溶液2～3μl，在10～12V/cm電壓梯度下電泳。電泳區帶距離以4～5cm爲宜。
（3）染色 電泳完畢，將膜條取下浸於氨基黑染色液中，2～3分鐘後，用漂洗液浸洗數次，直至脫去底色爲止。
（4）透明 將洗淨並完全乾後的膜條浸於透明液中10～15分鐘，取出平鋪於潔淨的玻璃板上，幹後即成透明薄膜，可於分光光度計上測定和作標本長期保存。
（5）含量測定 未經透明處理的醋酸纖維素薄膜電泳圖可按各品種項下規定的方法測定，一般採用洗脫法或掃描法，測定各蛋白質組分的相對含量（%）。
洗脫法 將洗淨的膜條用濾紙吸乾，剪下供試品溶液各電泳圖譜的電泳區帶，分別浸於1.6%的氫氧化鈉溶液中，振搖數次，至洗脫完全，於一定波長下測定吸光度。同時剪取與供試品膜條相應的無蛋白部位，同法操作作對照。先計算吸光度總和，再計算各蛋白組分所佔比率（%）。
掃描法 將乾燥的醋酸纖維素薄膜用色譜掃描儀通過反射（未透明薄膜）或透射（已透明薄膜）方式在記錄器上自動繪出各蛋白組分曲線圖，橫座標爲膜條的長度，縱座標爲吸光度，計算各蛋白質組分的含量（%）。亦可用微機處理積分計算。
7.3 第三法 瓊脂糖凝膠電泳法
7.3.1 1．儀器裝置
7.3.2 2．試劑
（1）醋酸－鋰鹽緩衝液（pH3.0） 取冰醋酸50ml，加水800ml混合後，用氫氧化鋰調節pH值至3.0，再加水至1000ml。
（2）甲苯胺藍溶液 取甲苯胺藍0.1g，加水100ml使溶解。
7.3.3 3．操作法
（1）制膠 取瓊脂糖約0.2g，加水10ml，置水浴中加熱使溶脹完全，加溫熱的醋酸－鋰鹽緩衝液（pH3.0）10ml，混勻，趁熱將膠液塗布於大小適宜（2.5cm×7.5cm或4cm×9cm）的玻璃板上，厚度約3mm，靜置，待凝膠結成無氣泡的均勻薄層，即得。
（3）點樣與電泳 在電泳槽內加入醋酸－鋰鹽緩衝液（pH3.0），將凝膠板置於電泳槽架上，經濾紙橋浸入緩衝液。於凝膠板負極端分別點樣1μl，立即接通電源，在電壓梯度約30V/cm、電流強度1～2mA/cm的條件下，電泳約20分鐘，關閉電源。
（4）染色與脫色 取下凝膠板，用甲苯胺藍溶液染色，用水洗去多餘的染色液至背景無色爲止。
7.4 第四法 聚丙烯酰胺凝膠電泳法
7.4.1 1．儀器裝置
通常由穩流電泳儀和圓盤電泳槽或平板電泳槽組成。其電泳室有上、下兩槽，每個槽中都有固定的鉑電極，鉑電極經隔離電線接於電泳儀穩流檔上。
7.4.2 2．試劑
（1）溶液A 取三羥甲基氨基甲烷36.6g、四甲基乙二胺0.23ml，加1mol/L鹽酸溶液48ml，再加水溶解並稀釋至100ml，置棕色瓶內，在冰箱中保存。
（2）溶液B 取丙烯酰胺30.0g、次甲基雙丙烯酰胺0.74g，加水溶解並稀釋至100ml，濾過，置棕色瓶內，在冰箱中保存。
（3）電極緩衝液（pH8.3） 取三羥甲基氨基甲烷6g、甘氨酸28.8g，加水溶解並稀釋至1000ml，置冰箱中保存，用前稀釋10倍。
（4）溴酚藍指示液 取溴酚藍0.1g，加0.05mol/L氫氧化鈉溶液3.0ml與90%乙醇5ml，微熱使溶解，加20%乙醇製成250ml。
（5）染色液 取0.25%（g/ml）考馬斯亮藍G250溶液2.5ml，加12.5% （g/ml）三氯醋酸溶液至10ml。
（6）稀染色液 取上述染色液2ml，加12.5%（g/ml）三氯醋酸溶液至10ml。
7.4.3 3．操作法
（1）制膠 取溶液A 2ml，溶液B 5.4ml，加脲2.9g使溶解，再加水4ml，混勻，抽氣趕去溶液中氣泡，加0.56%過硫酸銨溶液2ml，混勻製成膠液，立即用裝有長針頭的注射器或細滴管將膠液沿管壁加至底端有橡皮塞的小玻璃管（10cm×0.5cm）中，使膠層高度達6～7cm，然後徐徐滴加水少量，使覆蓋膠面，管底氣泡必須趕走，靜置約30分鐘，待出現明顯界面時即聚合完畢，吸去水層。
（3）電泳 將已制好的凝膠玻璃管裝入圓盤電泳槽內，每管加供試品或對照品溶液50～100μl，爲防止擴散可加甘油或40%蔗糖溶液1～2滴及0.04%溴酚藍指示液1滴，也可直接在上槽緩衝液中加0.04%溴酚藍指示液數滴，玻璃管的上部用電極緩衝液充滿，上端接負極，下端接正極。調節起始電流使每管爲1mA，數分鐘後，加大電流使每管爲2～3mA，當溴酚藍指示液移至距玻璃管底部1cm處，關閉電源。
（4）染色和脫色 電泳完畢，用裝有長針頭並吸滿水的注射器，自膠管底部沿膠管壁將水壓入，膠條即從管內滑出，將膠條浸入稀染色液過夜或用染色液浸泡10～30分鐘，以水漂洗乾淨，再用脫色液脫色至無蛋白區帶凝膠的底色透明爲止。
（5）結果判斷 將膠條置燈下觀察，根據供試品與對照品的色帶位置和色澤深淺程度進行判斷。
①相對遷移率 供試品和對照品的電泳區帶有時可用相對遷移率（R'm）進行比較。其計算式如下：
②掃描 將清晰的膠條置雙波長薄層掃描儀或凝膠電泳掃描儀中掃描並積分，由各組分的峯面積計算含量（%）。
7.5 第五法 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法
SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白質的原理是根據大多數蛋白質都能與陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉（SDS）按重量比結合成複合物，使蛋白質分子所帶的負電荷遠遠超過天然蛋白質分子的淨電荷，消除了不同蛋白質分子的電荷效應，使蛋白質按分子大小分離。
7.5.1 1．儀器裝置
恆壓或恆流電源、垂直板或圓盤電泳槽和制膠模具。
7.5.2 2．試劑
（1）30%丙烯酰胺溶液 取丙烯酰胺60g與亞甲基雙丙烯酰胺1.6g，加水至200ml，濾紙過濾，避光保存。
（2）分離膠緩衝液 取三羥甲基氨基甲烷36.3g，加水70ml，用鹽酸調節pH值至8.8，加水至100ml。
（3）濃縮膠緩衝液 取三羥甲基氨基甲烷6.0g，加水70ml，用鹽酸調節pH值至6.8，加水至100ml。
（4）電極緩衝液 取三羥甲基氨基甲烷6.0g、甘氨酸28.8g、十二烷基硫酸鈉1.0g，加水至1000ml。
7.5.3 3．操作法
（1）制膠 用30%丙烯酰胺溶液－分離膠緩衝液－20%十二烷基硫酸鈉溶液－10%過硫酸銨溶液（新鮮配製）－四甲基乙二胺－水（5.0：1.5；0.08：0.1：0.01：5.3）製成分離膠液，灌入模具內至一定高度（剩餘體積留作製備濃縮膠用），用水封頂，聚合完畢，傾去水層。再用30%丙烯酰胺溶液－濃縮膠緩衝液－20%十二烷基硫酸鈉溶液－10%過硫酸銨溶液（新鮮配製）－四甲基乙二胺－水（0.8：1.3：0.025：0.05：0.005：2.4）製成濃縮膠液，灌在分離膠上，插入樣品梳（如爲圓盤電泳，用水封頂），待濃縮膠液聚合後，小心除去樣品梳或水。
（3）電泳 垂直板電泳：恆壓電泳，初始電壓爲80V，進入分離膠時調至150～200V，當溴酚藍遷移膠底處，停止電泳。圓盤電泳：調節電流使每管8mA。
7.5.4 4．固定與染色
7.5.4.1 （1）考馬斯亮藍染色
①試劑 固定液 稱取三氯醋酸5g，加水200ml溶解後，加甲醇200ml，再加水至500ml。
染色液 稱取考馬斯亮藍R250 0.5g，加水200ml溶解後，加甲醇200ml與冰醋酸50ml，再加水至500ml。
脫色液 取甲醇400ml、冰醋酸100ml，加水至1000ml，充分混合。
②固定與染色 電泳完畢，取出膠片（條），置固定液中30分鐘，取出膠片（條），置染色液中1～2小時，用脫色液脫色至凝膠背景透明後保存在保存液中。
7.5.4.2 （2）銀染色
①試劑 硝酸銀溶液 取硝酸銀0.8g，加水至4.0ml，將此溶液滴加到0.1mol/L氫氧化鈉溶液20ml與25%氨溶液1.5ml的混合液中，搖勻，用水稀釋至100ml。
固定液 取甲醇50ml、37%甲醛溶液54μl，加水至100ml。
顯色液 取1%枸櫞酸溶液2.5ml、37%甲醛溶液270μl，加水至500ml。
終止液 取冰醋酸100ml，加水至1000ml。
②固定與染色 膠片浸在固定液中至少2小時後棄去固定液，用水浸洗至少1小時；膠片置1%戊二醛溶液中15分鐘後，用水洗2次，每次15分鐘；膠片置硝酸銀溶液中15分鐘後，用水洗3次，每次15分鐘；膠片置顯色液中，待各帶顯出後置終止液中。
7.5.5 5．結果判斷
用卡尺或用掃描定位法測量溴酚藍指示劑和蛋白遷移距離（如爲圓盤電泳還應測量染色前後膠條長度，垂直板電泳膠片厚度低於1mm，染色前後膠片長度基本不變）。按下式計算相對遷移率：
（2）分子量 以R'm爲橫座標，標準蛋白質的分子量對數值爲縱座標，進行線性迴歸，由標準曲線求得供試品的分子量。
（3）純度 取膠片（條），置薄層掃描儀，以峯面積按歸一化法計算。
7.6 第六法 等電聚焦水平板電泳法
兩性電解質在電泳場中形成一個pH梯度，由於蛋白質爲兩性化合物，其所帶的電荷與介質的pH值有關，帶電的蛋白質在電泳中向極性相反的方向遷移，當到達其等電點（此處的pH值使相應的蛋白質不再帶電荷）時，電流達到最小，不再移動。本法用於檢測蛋白類和肽類供試品的等電點。
7.6.1 1．儀器裝置
恆壓或恆流電源、帶有冷卻裝置的水平電泳槽和制膠模具。
7.6.2 2．試劑
（1）水（電導率應不大於0.056μS/cm）。
（2）A液 稱取丙烯酰胺5.0g，亞甲基雙丙烯酰胺0.15g，加適量水溶解，並稀釋至50ml，雙層濾紙濾過，避光保存。
（4）甲基紅試液 稱取甲基紅5mg，加0.05mol/L氫氧化鈉10ml溶解，混勻。
（5）50%甘油。
7.6.3 3．操作法
（1）制膠 取A液2.5ml，pH 3～10的兩性電解質（或其他pH範圍的兩性電解質）0.35ml，水1.25ml，50%甘油0.5ml，混勻，抽氣5～10分鐘，加B液25μl,N,N,N',N'-四甲基乙二胺6μl，混勻後緩慢地注入水平模具內，室溫下聚合。
（2）對照品溶液和供試品溶液的製備 按各品種項下的方法製備。如供試品所含鹽濃度較高，則將供試品對水透析（或用其他方法）脫鹽，並將蛋白或多肽含量調節至0.5～5mg/ml（如供試品蛋白或多肽濃度太低，則需採用適當方法濃縮）。對照品溶液同法制備。
（3）預電泳 將已聚合的聚丙烯酰胺凝膠放到冷卻板上，其間塗以液體石蠟或煤油並避免氣泡的產生。用正極液與負極液分別潤溼正極與負極電極條，然後分別放於陽極與陰極上，將電極對準電極條中心，加蓋，在恆壓法下進行測定，在起始電壓200V下預電泳30分鐘。
（4）電泳 將加樣濾紙條以一定間隔置於凝膠上，加入供試品、對照品及等電點標準溶液5～20μl。選擇恆壓方式進行電泳，起始電壓爲200V。電泳0.5～1小時待甲基紅遷出加樣條後，去除加樣條。調高電壓至400V，電泳至電流不再變化，再調高電壓至600V，待電流不再變化時停止電泳。預製膠的預電泳及電泳，按照各等電聚焦電泳儀標準操作規程進行。
7.6.4 4．固定和染色
（1）試劑
①固定液 20%三氯醋酸。
②染色液 染色貯備液 稱取考馬斯亮藍G250 1.0g，加水20ml溶解，作爲溶液1；稱取硫酸銨125g，加水400ml溶解，作爲溶液2；稱取磷酸20g，作爲溶液3；將溶液3加入到溶液1中，待考馬斯亮藍G250完全溶解後，與溶液2混合，並加水至1L，混勻，即得，用前應充分搖勻。
工作染色液 取60ml染色貯備液，與30ml甲醇混勻，臨用新配。
（2）固定與染色 電泳完畢後，取出膠片，置於固定液中固定20分鐘以上，取出膠片，置染色液中3小時，用脫色液脫色至背景透明後取出晾乾，亦可做成幹膠永久保存。
7.6.5 5．結果判斷
將膠片置凝膠電泳掃描儀中掃描，通過適宜的方法測量蛋白質或多肽與等電點標準的遷移距離。[1]
（2）等電點 以等電點標準試劑中各種蛋白的等電點（pI）對其相應的遷移距離線性迴歸作圖；將供試品的遷移距離代入線性迴歸方程，求出供試品的等電點。
8 附錄Ⅴ G 毛細管電泳法
毛細管電泳法是指以彈性石英毛細管爲分離通道，以高壓直流電場爲驅動力，依據供試品中各組分的淌度（單位電場強度下的遷移速度）和（或）分配行爲的差異而實現各組分分離的一種分析方法。
當熔融石英毛細管內充滿操作緩衝液時，管內壁上硅羥基解離釋放氫離子至溶液中使管壁帶負電荷並與溶液形成雙電層（ζ電位），即使在較低pH值的緩衝液中情況也如此。當毛細管兩端加上直流電壓時將使帶正電的溶液整體地移向負極端。此種在電場作用下溶液的整體移動稱爲電滲流（EOF）。內壁硅羥基的解離度與操作緩衝液pH值和添加的改性劑有關。降低溶液pH值會降低解離度，減小電滲流；增高溶液pH值提高解離度，增加電滲流。有機添加劑的加入有時會抑制內壁硅羥基的解離，減小電滲流。在操作緩衝液中帶電粒子在電場作用下以不同速度向極性相反的方向移動，形成電泳。在操作緩衝液中帶電粒子運動速度等於其電泳速度和電滲速度的矢量和。電滲速度通常大於電泳速度，因此電泳時各組分即使是陰離子也會從毛細管陽極端流向陰極端。爲了減小或消除電滲流，除了降低操作緩衝液pH值之外，還可以採用內壁聚合物塗層的毛細管。這種塗層毛細管可減少大分子在管壁上的吸附。
8.1 1．分離模式
（1）毛細管區帶電泳（CZE） 將待分析溶液引入毛細管進樣一端，施加直流電壓後，各組分按各自的電泳流和電滲流的矢量和流向毛細管出口端，按陽離子、中性粒子和陰離子及其電荷大小的順序通過檢測器。中性組分彼此不能分離。出峯時間稱爲遷移時間（tm），相當於高效液相色譜和氣相色譜中的保留時間。
（2）毛細管凝膠電泳（CGE） 在毛細管中裝入單體和引發劑引發聚合反應生成凝膠，這種方法主要用於分析蛋白質、DNA等生物大分子。另外還可以利用聚合物溶液，如葡聚糖等的篩分作用進行分析，稱爲毛細管無膠篩分。有時將它們統稱爲毛細管篩分電泳，下分爲凝膠電泳和無膠篩分兩類。
（3）毛細管等速電泳（CITP） 採用前導電解質和尾隨電解質，在毛細管中充入前導電解質後，進樣，電極槽中換用尾隨電解質進行電泳分析，帶不同電荷的組分遷移至各個狹窄的區帶，然後依次通過檢測器。
（4）毛細管等電聚焦電泳（CIEF） 將毛細管內壁塗覆聚合物減小電滲流，再將供試品和兩性電解質混合進樣，兩個電極槽中分別加入酸液和鹼液，施加電壓後毛細管中的操作電解質溶液逐漸形成pH梯度，各溶質在毛細管中遷移至各自的等電點（pI）時變爲中性形成聚焦的區帶，而後用壓力或改變檢測器末端電極槽儲液的pH值的方法使溶質通過檢測器。
（5）膠束電動毛細管色譜（MEKC或MECC） 當操作緩衝液中加入大於其臨界膠束濃度的離子型表面活性劑時，表面活性劑就聚集形成膠束，其親水端朝外、疏水非極性核朝內，溶質則在水和膠束兩相間分配，各溶質因分配係數存在差別而被分離。對於常用的陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉，進樣後極強親水性組分不能進入膠束，隨操作緩衝液流過檢測器（容量因子k'=O）；極強疏水性組分則進入膠束的核中不再回到水相，最後到達檢測器（k'=∞）。常用的其他膠束試劑還有陽離子表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨、膽酸等。
（6）毛細管電色譜（CEC） 將細粒徑固定相填充到毛細管中或在毛細管內壁塗覆固定相以電滲流驅動操作緩衝液（有時再加輔助壓力）進行分離。
以上分離模式（1）和（5）使用較多。（5）和（6）兩種模式的分離機理以色譜爲主，但對荷電溶質則兼有電泳作用。
操作緩衝液中加入各種添加劑可獲得多種分離效果。如加入環糊精、衍生化環糊精、冠醚、血清蛋白、多糖、膽酸鹽或某些抗生素等，可拆分手性化合物；加入有機溶劑可改善某些組分的分離效果，以至可在非水溶液中進行分析。
8.2 2．對儀器的一般要求
（1）毛細管 用彈性石英毛細管，內徑50μm和75μm兩種使用較多（毛細管電色譜有時用內徑更大些的毛細管）。細內徑分離效果好，且焦耳熱小，允許施加較高電壓；但若採用柱上檢測，則因光程較短，其檢測限比較粗內徑管要差。毛細管長度稱爲總長度，根據分離度的要求，可選用20～100cm長度；進樣端至檢測器間的長度稱爲有效長度。毛細管常盤放在管架上控制在一定溫度下操作，以控制焦耳熱，操作緩衝液的黏度和電導率，對測定的重複性很重要。
（2）直流高壓電源 採用0～30kV（或相近）可調節直流電源，可供應約300μA電流，具有穩壓和穩流兩種方式可供選擇。
（3）電極和電極槽 兩個電極槽裏放入操作緩衝液，分別插入毛細管的進口端與出口端以及鉑電極；鉑電極連接至直流高壓電源，正負極可切換。多種型號的儀器將試樣瓶同時用作電極槽。
（4）沖洗進樣系統 每次進樣之前毛細管要用不同溶液沖洗，選用自動沖洗進樣儀器較爲方便。進樣方法有壓力（加壓）進樣、負壓（減壓）進樣、虹吸進樣和電動（電遷移）進樣等。進樣時通過控制壓力或電壓及時間來控制進樣量。
（5）檢測系統 紫外－可見分光檢測器、激光誘導熒光檢測器、電化學檢測器和質譜檢測器均可用作毛細管電泳的檢測器。其中以紫外－可見分光光度檢測器應用最廣，包括單波長、程序波長和二極管陣列檢測器。將毛細管接近出口端的外層聚合物剝去約2mm一段，使石英管壁裸露，毛細管兩側各放置一個石英聚光球，使光源聚焦在毛細管上，透過毛細管到達光電池。對無光吸收（或熒光）的溶質的檢測，還可採用間接測定法，即在操作緩衝液中加入對光有吸收（或熒光）的添加劑，在溶質到達檢測窗口時出現反方向的峯。
8.3 3．系統適用性試驗
爲考查所配置的毛細管分析系統和設定的參數是否適用，系統適用性的測試項目和方法與高效液相色譜法或氣相色譜法相同，相關的計算式和要求也相同；如重複性（相對標準偏差，RSD）、容量因子（k'）、毛細管理論板數（n）、分離度（R）、拖尾因子（T）、線性範圍、最低檢測限（LOD）和最低定量限（LOQ）等，可參照測定。具體指標應符合各品種項下的規定，特別是進樣精度和不同荷電溶質遷移速度的差異對分析精密度的影響。
8.4 4．基本操作
（1）按照儀器操作手冊開機，預熱，輸入各項參數，如毛細管溫度、操作電壓、檢測波長和沖洗程序等。操作緩衝液需過濾和脫氣。沖洗液、緩衝液等放置於樣品瓶中，依次放入進樣器。
（2）毛細管處理的好壞，對測定結果影響很大。未塗層新毛細管要用較濃鹼液在較高溫度（例如用1mol/L氫氧化鈉溶液在60℃）沖洗，使毛細管內壁生成硅羥基，再依次用0.1mol/L氫氧化鈉溶液、水和操作緩衝液各沖洗數分鐘。兩次進樣中間可僅用緩衝液沖洗，但若發現分離性能改變，則開始須用0.1mol/L氫氧化鈉溶液沖洗，甚至要用濃氫氧化鈉溶液升溫沖洗。凝膠毛細管、塗層毛細管、填充毛細管的沖洗則應按照所附介紹操作。沖洗時將盛溶液的試樣瓶依次置於進樣器，設定順序和時間進行。
（3）操作緩衝液的種類、pH值和濃度，以及添加劑[用以增加溶質的溶解度和（或）控制溶質的解離度、手性拆分等]的選定對測定結果的影響也很大，應照各品種項下的規定配製，根據初試的結果調整、優化。
（4）將供試品溶液瓶置於進樣器中，設定操作參數，如進樣壓力（電動進樣電壓）、進樣時間、正極端或負極端進樣、操作電壓或電流、檢測器參數等，開始測試。根據初試的電泳譜圖調整儀器參數和操作緩衝液以獲得優化結果。而後用優化條件正式測試。
（5）測試完畢後用水沖洗毛細管，注意將毛細管兩端浸入水中保存，如果長久不用應將毛細管用氮吹乾，最後關機。（6）由於進樣方法的限制，目前毛細管電泳的精密度比用定量閥進樣的高效液相色譜法要差，故定量測定以採用內標法爲宜。用加壓或減壓法進樣時，供試品溶液黏度會影響進樣體積，應注意保持試樣溶液和對照品溶液黏度一致；用電動法進樣時，被測組分因電歧視現象和溶液離子強度會影響待測組分的遷移量，也要注意其影響。
9 附錄Ⅴ H 分子排阻色譜法
分子排阻色譜法是根據待測組分的分子大小進行分離的一種液相色譜技術。分子排阻色譜法的分離原理爲凝膠色譜柱的分子篩機制。色譜柱多以親水硅膠、凝膠或經修飾凝膠如葡聚糖凝膠（Sephadex）和聚丙烯酰胺凝膠（Sepharose）等爲填充劑，這些填充劑表面分佈着不同尺寸的孔徑，藥物分子進入色譜柱後，它們中的不同組分按其分子大小進入相應的孔徑內，大於所有孔徑的分子不能進入填充劑顆粒內部，在色譜過程中不被保留，最早被流動相洗脫至柱外，表現爲保留時間較短；小於所有孔徑的分子能自由進入填充劑表面的所有孔徑，在色譜柱中滯留時間較長，表現爲保留時間較長；其餘分子則按分子大小依次被洗脫。
9.1 1．對儀器的一般要求
分子排阻色譜法所需的進樣器和檢測器同高效液相色譜法，液相色譜泵一般分常壓、中壓和高壓。在藥物分析中，尤其是分子量或分子量分佈測定中，通常採用高效分子排阻色譜法（HPSEC）。應選用與供試品分子大小相適應的色譜柱填充劑。使用的流動相通常爲水溶液或緩衝液，溶液的pH值不宜超出填充劑的耐受力，一般pH值在2～8範圍。流動相中可加入適量的有機溶劑，但不宜過濃，一般不應超過30%，流速不宜過快，一般爲0.5～1.0ml/min。
9.2 2．系統適用性試驗
高效分子排阻色譜法的系統適用性試驗中色譜柱的理論板數（n）、分離度、重複性、拖尾因子的測定方法，在一般情況下，同高效液相色譜法項下方法，但在高分子雜質檢查時，某些藥物分子的單體與其二聚體不能達到基線分離時，其分離度的計算公式爲：
9.3 3．測定法
（1）分子量測定法 一般適用於蛋白質和多肽的分子量測定。按各品種項下規定的方法，選用與供試品分子大小相適宜的色譜柱和適宜分子量範圍的對照品，除另有規定外，對照品與供試品均需使用二硫蘇糖醇（DTT）和十二烷基硫酸鈉（SDS）處理，以打開分子內和分子間的二硫鍵，並使分子的構型與構象趨於一致，經處理的蛋白質和多肽分子通常以線性形式分離，以對照品分子量（Mw）的對數值對相應的保留時間（tR）製得標準曲線的線性迴歸方程lgMw=a+btR，供試品以保留時間由標準曲線迴歸方程計算其分子量或亞基的分子量。
（2）生物大分子聚合物分子量與分子量分佈的測定法 生物大分子聚合物如多糖、多聚核苷酸和膠原蛋白等具有分子大小不均一的特點，故生物大分子聚合物分子量與分子量分佈是控制該類產品的關鍵指標。在測定生物大分子聚合物分子量與分子量分佈時，選用與供試品分子結構與性質相同或相似的對照品十分重要。
按各品種項下規定的方法，除另有規定外，同樣採用分子量對照品和適宜的GPC軟件，以對照品重均分子量（Mw）的對數值對相應的保留時間（tR）製得標準曲線的線性迴歸方程lgMw=a+btR，供試品採用適宜的GPC軟件處理結果，並按下列公式計算出供試品的分子量與分子量分佈。
Mn=∑RIi/∑（RIi/Mi）
Mw=∑（RIiMi）/∑RIi
D=Mw/Mn
式中Mn爲數均分子量；
Mw爲重均分子量；
D爲分佈係數；
RIi爲供試品在保留時間i時的峯高；Mi爲供試品在保留時間i時的分子量。
（3）高分子雜質測定法 高分子雜質係指供試品中含有分子量大於藥物分子的雜質，通常是藥物在生產或貯存過程中產生的高分子聚合物或在生產過程中未除盡的可能產生過敏反應的高分子物質。
定量方法
①主成分自身對照法 同高效液相色譜法項下規定。一般用於高分子雜質含量較低的品種。
③限量法 除另有規定外，規定不得檢出保留時間小於對照品保留時間的組分，一般用於混合物中高分子物質的控制。
④自身對照外標法 一般用於Sephadex G-l0凝膠色譜系統中β-內酰胺抗生素中高分子雜質的檢查。在該分離系統中，除部分寡聚物外，β-內酰胺抗生素中高分子雜質在色譜過程中均不保留，即所有的高分子雜質表現爲單一的色譜峯，以供試品自身爲對照品，按外標法計算供試品中高分子雜質的相對百分含量。
9.4 【附註】Sephadex G-l0的處理方法
色譜柱的填裝 裝柱前先將約15g葡聚糖凝膠SephadexG-10用水浸泡48小時，使之充分溶脹，攪拌除去空氣泡，徐徐傾入玻璃柱，一次性裝填完畢，以免分層，然後用水將附着玻璃管壁的Sephadex G-10洗下，使色譜柱面平整，新填裝的色譜柱要先用水連續沖洗4～6小時，以排出柱中的氣泡。供試品的加入 進樣可以採用自動進樣閥，也可以直接將供試品加在牀的表面（此時，先將牀表面的流動相吸乾或滲幹，立即將供試品溶液沿着色譜管壁轉圈緩緩加入，注意勿使填充劑翻起，待之隨着重力的作用滲入固定相後，再沿着色譜管壁轉圈緩緩加入3～5ml流動相，以洗下殘留在色譜管壁的供試品溶液）。
10 附錄Ⅴ J 離子色譜法
離子色譜法系採用高壓輸液泵系統將規定的洗脫液泵入裝有填充劑的色譜柱進行分離測定的色譜分析方法。注入的供試品由洗脫液帶入色譜柱內進行分離後，經過抑制器或衍生系統進入檢測器，由積分儀或數據處理系統記錄色譜信號。離子色譜法常用於無機陰離子、無機陽離子、有機酸、糖醇類、氨基糖類、氨基酸、蛋白質、糖蛋白等物質的定性和定量分析。它的分離機理主要爲離子交換，即基於離子交換樹脂上可解離的離子與流動相中具有相同電荷的溶質離子之間進行的可逆交換；離子色譜法的其他分離機理還有形成離子對、離子排阻等。
10.1 1．對儀器的一般要求
離子色譜儀器中所有與洗脫液或供試品接觸的管道、器件均應使用惰性材料，如聚醚醚酮（PEEK）等。儀器應定期檢定並符合有關規定。
（1）色譜柱 離子交換色譜的色譜柱填充劑有兩種，分別是有機聚合物載體填充劑和無機載體填充劑。
有機聚合物載體填充劑最爲常用，填充劑的載體一般爲苯乙烯－二乙烯基苯共聚物、乙基乙烯基苯－二乙烯基苯共聚物、聚甲基丙烯酸酯或聚乙烯聚合物等有機聚合物。這類載體的表面通過離子鍵附聚了大量具有陰離子交換功能基（如烷基季銨基、烷醇季銨基等）或陽離子交換功能基（如磺酸、羧酸、羧酸－膦酸和羧酸－膦酸冠醚等）的乳膠微粒，可分別用於陰離子或陽離子的交換分離。有機聚合物載體填充劑在較寬的酸鹼範圍（pH0～14）內具有較高的穩定性，且有一定的耐有機溶劑腐蝕性。
無機載體填充劑一般以硅膠爲載體。在硅膠表面的硅醇基通過化學鍵合季銨基等陰離子交換功能基或磺酸基、羧酸基等陽離子交換功能基，可分別用於陰離子或陽離子的交換分離。硅膠載體填充劑機械穩定性好、在有機溶劑中不會溶脹或收縮。硅膠載體填充劑在pH2～8的洗脫液中穩定，一般適用於陽離子樣品的分離。
（2）洗脫液 離子色譜對複雜樣品的分離主要依賴於色譜柱的填充劑，而洗脫液相對較爲簡單。分離陰離子常採用稀鹼溶液、碳酸鹽緩衝液等作爲洗脫液；分離陽離子常採用稀甲烷磺酸溶液等作爲洗脫液。通過增加或減少洗脫液中酸鹼溶液的濃度可提高或降低洗脫液的洗脫能力；在洗脫液內加入適當比例的有機改性劑，如甲醇、乙腈等可改善色譜峯峯形。製備洗脫液的去離子水應經過純化處理，電導率一般小於0.056μS/cm。使用的洗脫液需經脫氣處理，常採用氦氣在線脫氣的方法，也可採用超聲、減壓過濾或冷凍的方式進行離線脫氣。
（3）檢測器 電導檢測器是離子色譜常用的檢測器，其他檢測器有紫外檢測器、安培檢測器、蒸發光散射檢測器等。電導檢測器主要用於測定無機陰離子、無機陽離子和部分極性有機物，如羧酸等。離子色譜法中常採用抑制型電導檢測器，即使用抑制器將具有較高電導率的洗脫液在進入檢測器之前中和成具有極低電導率的水或其他較低電導率的溶液，從而顯著提高電導檢測的靈敏度。
安培檢測器用於分析解離度低，但具有氧化或還原性質的化合物。直流安培檢測器可以測定碘離子（I-）、硫氰酸根離子（SCN-）和各種酚類化合物等。積分安培檢測器和脈衝安培檢測器則常用於測定糖類和氨基酸類化合物。
紫外檢測器適用於在高濃度氯離子等存在下痕量的溴離子（Br-）、亞硝酸根離子（NO2-）、硝酸根離子（NO3-）以及其他具有強紫外吸收成分的測定。柱後衍生－紫外檢測法常用於分離分析過渡金屬離子和鑭系金屬等。
蒸發光散射、原子吸收、原子發射光譜、電感耦合等離子體原子發射光譜、質譜（包括電感耦合等離子體質譜）也可作爲離子色譜的檢測器。離子色譜在與蒸發光散射檢測器或（和）質譜檢測器等聯用時，一般採用帶有抑制器的離子色譜系統。
10.2 2．樣品處理
離子色譜法的色譜柱填充劑大多數不兼容有機溶劑，一旦污染後不能用有機溶劑清洗，所以離子色譜法對樣品處理的要求較高。對於基質簡單的澄清水溶液一般通過稀釋和0.45μm濾膜過濾後直接進樣分析。對於基質複雜的樣品，可通過微波消解、紫外光降解、固相萃取等方法去除干擾物後進樣分析。
10.3 3．系統適用性試驗
照高效液相色譜法（2010年版藥典二部附錄Ⅴ D）項下相應的規定。
10.4 4．測定法
（1）內標法
（2）外標法
（3）面積歸一化法
上述（1）～（3）法的具體內容均同高效液相色譜法（2010年版藥典二部附錄ⅤD）項下相應的規定。
（4）標準曲線法 按各品種項下的規定，精密稱（量）取對照品適量配製成貯備溶液。分別量取貯備溶液配製成一系列梯度濃度的對照溶液。量取上述梯度濃度的對照品溶液各適量注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品溶液中待測組分的峯面積或峯高。以標準溶液的峯面積或峯高爲縱座標，以標準溶液的濃度爲橫座標，迴歸計算標準曲線，其公式爲：
AR=a·CR+b
CR爲對照溶液的濃度；
a爲標準曲線的斜率；
b爲標準曲線的截距。
再取各品種項下供試品溶液，注入色譜儀，記錄色譜圖，測量供試品溶液中待測成分（或其雜質）的峯面積或峯高。按下式計算其濃度：
cS爲供試品溶液的濃度；
a、b符號的意義同上。
上述測定法中，以外標法和標準曲線法最爲常用。
11 參考資料
- ^ [1] 國家藥典委員會．中華人民共和國藥典：2010年版：第一增補本[M]．北京：中國醫藥科技出版社，2010．