3 免疫組化的概念
是應用免疫學基本原理——抗原抗體反應，即抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素) 顯色來確定組織細胞內抗原(多肽和蛋白質)，對其進行定位、定性及定量的研究，稱爲免疫組織化學技術(immunohistochemistry)或免疫細胞化學技術(immunocytochemistry)。
5 免疫組化實驗所用的組織和細胞標本
實驗所用主要爲組織標本和細胞標本兩大類，前者包括石蠟切片（病理大片和組織芯片）和冰凍切片，後者包括組織印片、細胞爬片和細胞塗片。
其中石蠟切片是製作組織標本最常用、最基本的方法，對於組織形態保存好，且能作連續切片，有利於各種染色對照觀察；還能長期存檔，供回顧性研究；石蠟切片製作過程對組織內抗原暴露有一定的影響，但可進行抗原修復，是免疫組化中首選的組織標本製作方法。
6 免疫組化實驗所用的抗體
免疫組化實驗中常用的抗體爲單克隆抗體和多克隆抗體。單克隆抗體是一個B淋巴細胞克隆分泌的抗體，應用細胞融合雜交瘤技術免疫動物製備。多克隆抗體是將純化後的抗原直接免疫動物後，從動物血中所獲得的免疫血清，是多個B淋巴細胞克隆所產生的抗體混合物。
7 免疫組化常用的染色方法
根據標記物的不同分爲免疫熒光法，免疫酶標法，親和組織化學法，後者是以一種物質對某種組織成分具有高度親合力爲基礎的檢測方法。這種方法敏感性更高，有利於微量抗原(抗體)在細胞或亞細胞水平的定位，其中生物素—抗生物素染色法最常用。
8 免疫組化操作步驟
8.1 免疫組化（ LP 法）操作步驟
2. 緩衝液洗 3min/2 次。
3. 爲了降低內源性過氧化物酶造成的非特異性背景染色 , 將切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分鐘。
4. 緩衝液洗 5min/2 次。
5. 滴加 Ultra V Block ， 在室溫下孵育 5 分鐘以封閉非特異性的背景染色。
（注：孵育不要超過 10 分鐘，否則會導致特異性染色降低。如果一抗的稀釋液中含有 5 － 10% 正常羊血清，這一步可以省略。）
6. 緩衝液洗 5min/2 次。
7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小時。（具體孵育時間和溫度由試驗者最終決定）
8. 緩衝液洗 5min/2 次。
9 ． 滴加 Primary Antibody Enhancer( 增強子 ) , 在室溫下孵育 20 分鐘。
10 ．緩衝液洗 5min/2 次。
11 ．滴加 HRP Polymer( 酶標二抗 ) ，在室溫下孵育 30 分鐘。
（注： HRP Polymer 對光敏感，應避免不必要的光暴露並儲存在不透明的小瓶中。）
12 ．緩衝液洗 5min/2 次。
13 ．向 1ml DAB Plus Substrate ( 或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen ） , 混勻後滴加到切片上，孵育 3 － 15 分鐘。（具體時間由染色深淺決定。）
14 ．自來水充分沖洗 , 復染，脫水 , 透明 , 封片。
8.2 免疫組化 ( 三步法 ) 操作步驟
（ 1 ）、石蠟切片脫蠟至水。
（ 2 ）、 3%H 2 O 2 室溫孵育 5-10 分鐘，以消除內源性過氧化物酶的活性。
（ 3 ）、蒸餾水沖洗， PBS 浸泡 5 分鐘 x2 （如需抗原修復，可在此步後進行）。
（ 4 ）、 5-10% 正常山羊血清（ PBS 稀釋）封閉，室溫孵育 10 分鐘，傾去血清，勿洗。滴加 一抗 工作液， 37 ℃ 孵育 1-2 小時或 4 ℃ 過夜。
（ 5 ）、 PBS 沖洗， 5 分鐘 x3 次。
（ 6 ）、滴加適量 生物素標記二抗 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分鐘。
（ 7 ）、 PBS 沖洗， 5 分鐘 x3 次。
（ 8 ）、滴加適量的 辣根酶或鹼性磷酸酶標記的鏈黴卵白素 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分鐘。
（ 9 ）、 PBS 沖洗， 5 分鐘 x3 次。
（ 10 ）、顯色劑顯色 3-15 分鐘（ DAB 或 NBT/BCIP ）
8.3 冰凍切片免疫組化染色步驟
冰凍切片 4-8um ，室溫放置 30 分鐘後，入 4 ℃丙酮固定 10分鐘，PBS洗，5分鐘x3，用過氧化氫孵育5-10分鐘，消除內源性過氧化物酶的活性。
9 免疫組化實驗結果的判定和分析
從實驗結果而言，免疫組化技術服務主要涉及抗體實驗結果的描述與分析，圖片的確定與選取，相關數據的提供，上述工作是免疫組化工作的重點內容，只有嚴格的實驗設計，標準的實驗操作，專業化的結果分析才能更好的滿足客戶的要求，這點對於形式爲腹水，上清，培養液之類的抗體顯得更爲重要。關於上述服務內容應該在實驗開始前由雙方明確，一般而言，客戶方實驗前應提出需要什麼樣的結果與分析，例如是簡要還是詳細的描述實驗結果，需要實驗數據否，圖片的數量與規格等。如果爲雙盲試驗或有第三方參與，則事先申明。
10 免疫組化在臨牀工作的意義
近年來，隨着免疫組織化學技術的發展和各種特異性抗體的出現，使許多疑難腫瘤得到了明確診斷。在常規腫瘤病理診斷中，5%-10%的病例單靠 H.E.染色難以作出明確的形態學診斷。尤其是免疫組化在腫瘤診斷和鑑別診斷中的實用價值受到了普遍的認可，其在低分化或未分化腫瘤的鑑別診斷時，準確率可達50%-75%。
(1)惡性腫瘤的診斷與鑑別診斷；
(2)確定轉移性惡性腫瘤的原發部位；
(3)對某類腫瘤進行進一步的病理分型；
（4）軟組織腫瘤的治療一般需根據正確的組織學分類，因其種類多、組織形態相像，有時難以區分其組織來源，應用多種標誌進行免疫組化研究對軟組織腫瘤的診斷是不可缺少的；
（5）發現微小轉移竈，有助於臨牀治療方案的確定，包括手術範圍的確定。
（6）爲臨牀提供治療方案的選擇。